引用本文
祝进, 陆军, 余旭良, 白永凤. 不同来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力基因的研究. 2012, 27(6): 475-478
ZHU Jin, LU Jun, YU Xuliang, BAI Yongfeng. Research on virulence gene of multi-source methicillin-resistantStaphylococcus aureus . Labratory Medicine, 2012, 27(6): 475-478  
Permissions
Copyright©2012, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
不同来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力基因的研究
祝进, 陆军, 余旭良, 白永凤
衢州市人民医院,浙江 衢州 324000

作者简介：祝进,男,1969年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物学实验诊断工作。

摘要
目的

对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染状况进行分析,并通过对MRSA菌株、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株毒力基因的检测,分析比较不同金黄色葡萄球菌(SA)的毒力基因分布。

方法

收集衢州市人民医院2009年1月至2011年6月临床标本分离的MRSA菌株60株,MSSA菌株54株。采用聚合酶链反应(PCR)检测不同标本分离的SA的杀白细胞素(pvl)、肠毒素C(sec)、肠毒素H(seh)、α-溶血素(hla)、β-溶血素(hlb)、黏附素凝聚因子(clfA 、clfB)、纤连蛋白结合蛋白(fnbA、fnbB)毒力基因。

结果

60株MRSA菌株主要分布在神经外科、普外科、小儿科、骨科等病区,其中17株为社区获得性MRSA(CA-MRSA),43株为医院获得性MRSA(HA-MRSA)。MRSA菌株中pvl的检出率明显高于MSSA菌株,而clfA、fnbA、sec、she的检出率明显低于MSSA。而pvl、fnbA在CA-MRSA中的检出率要高于HA-MRSA。

结论

临床分离的SA中,MSSA菌株毒力相对MRSA可能更高,而CA-MRSA相对HA-MRSA毒力也较强,他们之间携带毒力基因的差别可能与之侵袭的感染部位相关。

关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌; 社区获得性; 医院获得性; 毒力基因
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)06-475-04
Research on virulence gene of multi-source methicillin-resistantStaphylococcus aureus
ZHU Jin, LU Jun, YU Xuliang, BAI Yongfeng
Quzhou People's Hospital,Zhejiang Quzhou 324000,China
Abstract
Objective

To investigate the infection status of clinical methicillin-resistantStaphylococcus aureus (MRSA), and analyze the distribution ofStaphylococcus aureus (SA) virulence gene in clinical detection of MRSA and methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus (MSSA).

Methods

A total of 60 clinical MRSA isolates and 54 clinical MSSA isolates were collected from January 2009 to June 2011 in Quzhou People's Hospital. Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect virulence gene panton-valentine leukocidin(pvl),staphylococcal enterotoxin C(sec),staphylococcal enterotoxin H(seh),hemolysin A (Hla),hemolysin B(Hlb),clumping factor A(clfA),clumping factor B(clfB),fibronection-binding protein A(fnb A) and fibronection-binding protein protein B(fnbB)of these clinical SA isolates.

Results

A majority of 60 MRSA isolates distributed in Neurosurgery,General Surgery, Paediatrics and Orthopaedics Departments. The 17 isolates of 60 MRSA were considered as community-associated MRSA(CA-MRSA), and 43 isolates of 60 MRSA were hospital-associated MRSA(HA-MRSA). In contrast to MSSA, the positive detection rate ofpvl in MRSA was higher, but the positive detection rates ofclfA,fnbA,sec andseh were lower. The positive rates ofpvl andfnbA in CA-MRSA were higher than those in HA-MRSA.

Conclusions

The virulence of MSSA isolates is probably higher than that of MRSA. The virulence of CA-MRSA isolates is higher than that of HA-MRSA.The different distribution of the virulence genes of these clinical SA isolates may be associated with the site of infection.

Keyword: Methicillin-resistantStaphylococcus aureus; Methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus; Community-association; Hospital-association; Virulence gene
引言

金黄色葡萄球菌(SA)是一种革兰阳性球菌,广泛分布于自然界,可以引起人和动物的感染,是社区和医院感染的常见病原菌之一。其有很强的毒力和侵袭力,可产生多种溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素、血浆凝固酶等,易引起化脓性炎症。随着β-内酰胺类抗菌药物的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 随之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加。上世纪90年代初,澳大利亚、美国、欧洲、亚洲等先后报道了社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)[ 1]。资料显示CA-MRSA的比例占MRSA分离率的8%~20%之间[ 2],并且和医院获得性金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)在致病性、耐药性等方面有明显差别。为了解衢州市人民医院所分离的SA中各种与致病相关的毒力基因携带率,掌握不同来源MRSA的感染特征及所携带毒力基因的情况,有效控制医院感染传播以及合理制定治疗方案提供科学依据,对2009年1月至2011年6月期间所分离的60株MRSA及54株同期的MSSA进行毒力基因检测和分析。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 收集2009年1月至2011年6月自衢州市人民医院门诊及住院患者分离的MRSA 60株,同期分离的MSSA 54株做为参照,剔除重复菌株。

2. 试剂及引物 Lysostaphin(SD9001)、Gelred和蛋白酶K,购自上海生工生物工程技术有限公司; dNTP、rTaqDNA聚合酶、上样缓冲液及DNA相对分子质量Marker(DL2000),购自大连宝生物工程有限公司;聚合酶链反应(PCR)引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

3. 仪器 BIO-RAD S1000 Thermal Cycler型PCR仪;BIO-RAD PowerPac Basic型电泳仪;BIO-RAD Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪。

二、方法

1. 头孢西丁与苯唑西林筛选MRSA 临床标本分离的可疑菌落在鉴定的同时按美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准筛选MRSA,头孢西丁使用纸片扩散法,苯唑西林使用最底抑菌浓度(MIC)法同时进行检测。

2. PCR检测 mecA基因和16SrRNA基因,对SA和MRSA进行确认。

3. 细菌总DNA的提取 吸取250μL双蒸水,挑取血平板过夜培养的SA菌落23个,加入双蒸水中,混匀后,再加入蛋白酶K(0.2mg/m1)和溶葡萄球菌素(16 U/mL),37 ℃作用1 h,加热煮沸15min,在低温高速离心机中以2 000×g离心5min.将上清液转移到干净的无菌微量离心管中,即为细菌总DNA溶液,-20 ℃保存备用。

4. mecA、16srRNA和各种毒力基因检测 mecA、16srRNA、 pvl及 se引物及反应条件按照文献[3]操作; Hla及 hlb引物、反应条件按照文献[4]操作; Fnb及 clf引物、反应条件按照文献[5]操作。

5. PCR产物分析 取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE,琼脂糖浓度为1%,取4μL PCR扩增产物与2μL含有Gelred的溴酚蓝混匀后加样,电泳电压为120V,时间20min,凝胶成像仪拍照观察结果。扩增产物送测序公司测序,并通过BLAST网站比对测序结果序列加以确认。

6. 临床资料采集 参照卫生部医政司医院感染监控小组制定的诊断标准,将经过上述MRSA菌株分为社区获得性MRSA组与医院获得性MRSA组。

三、 统计学方法

对CA-MRSA组与HA-MRSA组感染部位及各分组毒力基因携带率进行统计学分析,采用卡方检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、 MRSA的鉴定结果

所有菌株16srRNA基因检测阳性;60株MRSA头孢西丁纸片法抑菌圈≤21mm, mecA基因检测阳性,而54株MSSA 2种方法检测阴性。

二、临床标本中分离的MRSA分析

60株耐MRSA中,标本来源以痰液最多,为37株,占61.17%,其余依次为脓液14株(23.33%),血液6株(10.00%)、尿液2株(3.33%)、胸水1株(1.67%)。MRSA菌株以神经外科最多,占15株(25.00%),依次为普外科6株(10.00%)、小儿科6株(10.00%)、骨科5株(8.33%)、肾内科5株(8.33%)、中医康复科5株(8.33%)、神经内科4株(6.67%)。60株MRSA中17株为CA-MRSA(28.33%);43株为HA-MRSA(71.67%),见 表1。

表1 CA-MRSA与HA-MRSA的感染部位比较(%)
三、毒力基因检测结果

60株MRSA菌株及54株MSSA菌株均进行了9种常见毒力基因的PCR扩增检测。结果显示MRSA中 pvl阳性的比率(11/60)明显高于MSSA(3/54),差异有统计学意义( P<0.05)。 hla、 hlb在MSSA和MRSA中的阳性率分别为96.0%和70.0%。 clfA在MSSA中的检出率达到98.1%,而在MRSA中仅有68.3%,差异有统计学意义( P<0.000 1); fnbA在MSSA和MRSA中的携带率分别为79.6%和61.7%, fnbB差异无统计学意义。本研究54株MSSA中有13株检出 sec,10株检出 seh; MSSA虽然耐药性不强,但却保持了相当高的毒力。MRSA菌株的毒力稍弱,60株中 sec阳性检出率2株,见 表2。

表2 MSSA和MRSA毒力基因检出率的比较(%)
四、CA-MRSA和HA-MRSA的毒力基因检出情况

实验显示CA-MRSA中的 pvl基因比率明显>HA-MRSA中的 pvl基因( P<0.05)。在CA-MRSA和HA-MRSA之间检出率差异有统计学意义的基因还有 fnbA,分别占CA-MRSA的82.4%和HA-MRSA的53.5%,见 表3。

表3 CA-MRSA与HA-MRSA之间毒力基因检出率的比较(%)
讨论

SA是引起医院感染和社区感染的重要致病菌。青霉素的问世曾使SA感染得到强有效的控制,但随之产生的对抗菌药物的耐药问题,尤其是MRSA的出现,给临床治疗提出了新的挑战。MRSA已成为医院感染的重要病原菌之一,感染多见于有严重基础疾病、免疫功能低下,并使用侵入性操作和广谱抗菌药物者[ 6]。MRSA的标本来源以痰液的比例最高,占63.3%,说明MRSA的感染以呼吸道感染最为常见,这和文献报道[ 7]相似。MRSA感染患者在医院科室中的分布以神经外科为最多,其次为普外科、小儿科、骨科、肾内科、中医康复科、神经内科、肿瘤外科和重症监护室等。这些病区多为住院时间较长、机体抵抗力弱且病情危重的患者及侵入性诊疗操作较多,如各种插管、导尿管及使用呼吸机等,容易被MRSA病原菌所污染,导致了MRSA的传播。因此,在较多使用呼吸机、动静脉导管插入等侵袭性操作的科室,要重点进行MRSA的连续性监测及干预,防治MRSA的爆发性流行。

根据美国疾病预防控制中心(CDC)的标准,MRSA感染的患者在此次感染之前的一年内没有接受过住院治疗或临床医疗操作(如外科手术、血液透析或留置导管等),可认为是CA-MRSA感染。我国卫生部一般则规定门诊患者感染MRSA或住院患者在入院48 h内发生感染称为CA-MRSA。本研究中,我院的MRSA中HA-MRSA占71.67%,说明医院获得性感染仍是最主要的MRSA感染源。因此,医院须严格执行医院感染控制制度,做好隔离、消毒措施,预防院内传播。CA-MRSA占所有分离MRSA的28.33%,这高于乔甫等[ 8]的13.50%,这可能与地域性和患者来源有关。在MRSA感染/定植的部位上,HA-MRSA主要为呼吸道感染,而CA-MRSA则以皮肤软组织感染和呼吸道感染为主,这与国内的研究相似[ 8]。

本研究结果显示 clfA、 fnbA、 sec在MSSA中的检出率都明显高于MRSA中的检出率,在一定程度上说明MSSA虽然在耐药程度上不如MRSA,但在毒力、致病力方面却可能强过MRSA。

本研究MRSA菌株 pvl基因的检出率明显>MSSA,CA-MRSA中的检出率也明显>HA-MRSA,和文献报道[ 9]类似。携带 pvl基因的MRSA菌株既保持了其高度耐药性,又编码毒力基因增加了其致病力,有利于该菌株的临床环境中的生存,适于在进化中被选择出来。一般认为SA通过噬菌体溶源转换机制获得产 pvl能力,并可能存在通过质粒途径在不同菌株间水平传播。因此, pvl基因被HA-MRSA所携带并造成传播可能性很大,其传播必然加大MRSA流行所造成的危害,对MRSA菌株监测筛查 pvl基因值得临床高度重视。

fnbA在CA-MRSA中的比率明显高于HA-MRSA。 pvl在SA所致的皮肤及软组织损害和坏死性肺炎等疾病中起重要作用, fnbA增强SA在创伤表面的黏附聚集能力,2者相互叠加作用可能是CA-MRSA引起创伤感染(脓液)的比率远高于HA-MRSA的重要原因。除 pvl和 fnbA外的7种毒力基因的检出率在CA-MRSA和HA-MRSA间均没有明显的差别。

MRSA及所携带的毒力基因使其成为医院或者社区获得性感染的主要致病菌,也给临床治疗带来严峻挑战。因此,检测MRSA的毒力基因可以为临床治疗和感染控制措施提供依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Witte W. Community-acquired methicillin-resistant Sta-phylococcus aureus: what do we need to know[J]. Clin Microbiol Infect, 2009, 15(Suppl 7): 17-25. [本文引用:1] [JCR: 4.578]
[2] Fridkin SK, Hageman JC, Morrison M, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease in three communities[J]. N Engl J Med, 2005, 352(14): 1436-1444. [本文引用:1]
[3] 杜娜, 王辉, 牛俊奇, 等. 我国五家教学医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型及毒素基因的检测[J]. 中华检验医学杂志, 2007, 30(5) : 499-504. [本文引用:1]
[4] 魏志恒, 于宏伟, 李宁, 等. 金黄色葡萄球菌溶血素基因分布的研究[J]. 中国食品学报, 2009, 9(6): 152-156. [本文引用:1]
[5] Gomes AR, Vinga S, Zavolan M, et al. Analysis of the genetic variability of virulence-related loci in epidemic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(1): 366-379. [本文引用:1]
[6] 王丽春, 李大江, 熊中华, 等. 金黄色葡萄球菌医院感染的临床及耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2008, 18(10): 1485-1488. [本文引用:1]
[7] 姚春艳, 府伟灵. 葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志, 2004, 14(1): 104-106. [本文引用:1]
[8] 乔甫, 谢轶, 庄红娣, 等. 医院与社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的目标监测[J]. 现代预防医学, 2011, 38(1): 67-69. [本文引用:2]
[9] Martinez-Aguilar G, Avalos-Mishaan A. Community-acquired, methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus musculoskeletal infections in children[J]. Pediatr Infect Dis J, 2004, 23(8): 701-706. [本文引用:1] [JCR: 3.569]