量子点标记快速免疫检测技术的研究
吴卫华1, 汤海英1, 张鹏飞2
1. 上海第九人民医院奉城分院,上海 201411
2. 上海艾力斯医药科技有限公司,上海 201203

通讯作者:张鹏飞,联系电话:021-32502530。

作者简介:吴卫华,男,1963年生,主管技师,主要从事临床生化和临床免疫检验工作。

摘要
目的

自制发光材料量子点,优化量子点与抗体的偶联方案,并对制备的量子点标记抗体进行免疫检测的可行性研究。

方法

采用高温热分解法制备得到镉硒(CdSe)量子点,用还原型谷胱甘肽(GSH)对量子点表面改性,使用双功能聚乙二醇(PEG)交联量子点表面的GSH,得到表面PEG化的水溶性量子点,该物质稳定性好。用抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体与量子点共价交联,采用斑点免疫反应验证HBsAg检测的可行性。

结果

成功制备量子点及其抗体标记物,检测HbsAg的敏感性可达1.6 ng/mL水平。

结论

量子点标记免疫检测呈现技术优势,有广阔的发展与应用前景。

关键词: 量子点; 抗乙肝表面抗原抗体; 快速免疫检测
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)06-448-03
Studies on quantum dot labeling rapid immunoassay
WU Weihua1, TANG Haiying1, ZHANG Pengfei2
1. Fengcheng Hospital,Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai 201411,China
2.Shanghai Allist Pharmaceuticals Inc., Shanghai 201203,China
Abstract
Objective

To study the feasibility of the immunoassay with homemade quantum dots with light-emitting materials and the coupling scheme optimization of these quantum dots with antibodies.

Methods

Thermal decomposition was used to prepare cadmium selenium(CdSe) quantum dots. The surface of quantum dots was modified with glutathione (GSH). Cross-linking attached GSH with bifunctional polyethylene glycol (PEG) was used to obtain water-soluble quantum dots wrapped with PEG, and it had good stability. Anti-hepatitis B surface antigen (HbsAg) antibody was used to prepare quantum dots for covalent cross-linking, and the feasibility of HBsAg immunoassay with the dot-immuno-reaction principle was evaluated.

Results

Preparations of quantum dots with light-emitting materials and antibodies labeled with them were successful. The sensitivity of HbsAg immunoassay was up to 1.6 ng/mL.

Conclusions

Immunoassay on quantum dot labeling antibodies is technically superior, with promising development and application.

Keyword: Quantum dot; Anti-hepatitis B surface antigen antibody; Rapid immunoassay
引言

微粒子发光(microparticle capture lumination)技术是近十几年来在酶联免疫吸附试验(ELISA)基础上发展起来的免疫检测技术平台[ 1- 2]。理论上微粒子发光检测的敏感度比ELISA提高数百至上千倍,而且微粒子发光免疫检测较之最初的免疫检测在敏感性、准确性、重复性和自动化程度上均有提高,是国外几大著名试剂公司目前在用的技术平台。

量子点是微粒子的一种特殊形式,具有某些独特的荧光性能[ 3],如荧光发射波长可控、发射峰狭窄对称、量子效率高、光稳定性好等,成为标记免疫检测的热点报告集团[ 4 ]

制备出荧光强度高、免疫活性好的量子点-抗体(QD-Ab)复合物是将量子点应用于免疫检测的前提[ 5]。我们在自制量子点并经系列修饰和抗体交联的基础上,探索该报告集团用于快速免疫检测的可行性,为制备高免疫活性的QD-Ab复合物并用于免疫检测提供依据。

材料和方法
一、试剂与仪器

氧化镉(CdO)、三辛基膦(TOP)和三辛基氧膦(TOPO)购自Sigma-Aldrich公司;硬脂酸锌、还原型谷胱甘肽(GSH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙醇胺(EA)等购自国药上海试剂公司;羊抗乙肝表面抗原多克隆抗体(Goat anti-HBsAg pAb)和灭活的乙肝表面抗原(HBsAg)购自上海叶民生物技术有限公司;琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、牛血清蛋白(BSA)和偏氟聚乙烯(PVDF)膜购自碧云天生物技术有限公司。UV-2550紫外-可见分光光度计(日本津岛公司);LS-55荧光分光光度计(美国perkinElmer公司);CP-100MX超速离心机(日本日立公司);天能1600凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)。

二、镉硒(CdSe)核壳量子点的合成与GSH修饰

对CdSe量子点的合成进行3次重复试验,分别在注射硒(Se)前体15、30 s和 1、2、4、8、16、30 min后取样,对合成样本进行紫外-可见吸收光谱测试。

三、GSH量子点的聚乙二醇(PEG)化及与抗HBsAg抗体的偶联

1. GSH量子点的PEG化 使用GSH对GSH-量子点进行表面交联,在得到交联和PEG化的量子点后,进行荧光稳定性能测试,电泳图表征粒径分布。

2. 量子点与抗HBsAg抗体的偶联 在表面羧基活化后的量子点溶液中加入100 μL 抗HBsAg 多克隆抗体(4.5 mg/mL),置于30 ℃的摇床中避光反应2 h,然后在反应体系中加入适量的BSA、PEG-NH2、Tris或者乙醇胺封闭未反应的活化羧基位点,继续置于30 ℃的摇床中避光反应1 h。 除去反应体系中过量的游离抗体分子,产物52 000× g超速离心1 h,倒去上清,加入磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗液分散,再在相同条件下超速离心2次,得到红色沉淀分散在50%甘油PBS溶液中,即纯化的QD-Ab复合物。

四、抗原检测应用性研究

按常规免疫斑点印记法(Immune Dot-blot)检测HBsAg。准备硝酸纤维膜,用铅笔划格,吸取2 μL倍比稀释的HBsAg抗原液,以平面吸头缓慢点于膜上,干燥后用3%BSA室温封闭2 h。在20 mL培养皿内与量子点标记抗HBsAg抗体反应,摇动反应2 h。以PBST洗膜3 min, 倒净洗液,如此重复5次,膜干燥后在紫外光源下显示结果。

结果
一、合成量子点与GSH修饰

1. 合成量子点的紫外-可见吸收光谱随反应时间的变化 合成量子点的第一激子吸收峰随反应时间的进行,逐渐向红波长移动,表面量子点逐渐粒径增大,其第一激子吸收峰也发生红移,见 图1

图1 CdSe量子点的紫外-可见吸收光谱随反应时间的变化

2. GSH修饰量子点对转移效率的影响分别在量子点和GSH混合搅拌0、1、4和24 h后,旋蒸蒸发干燥,然后加水分散,加ZnCl2溶液提高量子效率。GSH和量子点充分反应后表面离子集团改变,但对电泳时的迁移无明显影响,使用傅星叶变换红外辐射(FTIR)光谱可表征红外光谱的变化和特征峰强度的变化。GSH修饰前、后量子点的电泳迁移见 图2

图2 GSH修饰的量子点的凝胶电泳图注:1、2、3分别是原溶液(约8 μmol/L)稀释10、20、50倍;4、5分别为GSH修饰的量子点透析前、后的凝胶电泳图谱

二、PEG化量子点与抗HBs的交联

GSH修饰后CdSe量子点为脂溶性量子点,用谷胱甘肽将量子点转移至水相,并在量子点表面偶联PEG分子,得到量子点溶液分散在硼酸盐缓冲液中待用。此时经多重修饰后的量子点变为水溶性,再应用双功能交联剂碳化二亚胺(EDC)将量子点与抗体共价连接。

三、HBsAg检测结果

Immune dot-blot 的检测结果见 图3

图3 QD-Ab复合物的凝胶电泳图和膜免疫反应图注:(a)凝胶电泳图,1~3分别为游离量子点、量子点∶抗体=1∶8复合物和量子点∶抗体=1∶16复合物;(b)膜免疫反应图,1为1∶4,2为1∶8;从左至右为倍比增高浓度的抗原,最左侧点的HbsAg浓度为1.6 ng/mL

讨论

纳米材料与技术用于医学检测是近年来的热点领域。量子点是纳米材料的一种特殊形式,是元素周期中某些特点分子的纳米结晶,直径在10 nm以下,具有更宽的吸光谱和非常窄的发光谱,而且同一材料随粒径不同其吸收光和发射光频率也不同。 量子点作为检测体系中的荧光报告信号受到广泛关注,其光学特性和稳定性大大扩展了标记范围和多指标检测标记同时应用的可行性[ 6, 7]。此外,其稳定性和低淬灭性较常规的染料荧光素高数十倍。作为载体,可像通常的纳米微粒一样标记培基或配体,承载免疫反应。作为标记材料,可使免疫反应的敏感度明显增加。

在完成量子点的制备和表面修饰后,与抗体的交联是决定该标记产物性能的关键环节。目前,多数报道均采用共价交联的方式[ 8]。因交联本身不具备定点能力,亦即抗体分子上的任一游离氨基均可发生反应,而抗体的氨基端才是与抗原结合的部分,最大限度的保持氨基端游离至关重要。此外,因量子点体积小,抗体是大分子,两者间的比例也是非常敏感的因素,本研究反复试验了不同比例的交联效果。

理论上,量子点标记有好的信号放大效果,因而有更高的敏感性。本研究应用最简单的不同浓度的抗原点样,以量子点标记直接反应,可检测到约2 ng/mL的范围,还没有达到最理想的效果。这可能是整体实验中各个环节还没能做到最优化,如QD-Ab复合物的纯化方法仍需要进一步优化,超速离心法需要进一步增加转速和延长离心时间,减少离心分离过程中抗体的损失,同时尝试使用凝胶渗透层析分离的方法看是否可以能够分离得到较好的分离效果等,抗体与量子点的交联比例,交联剂和方法的选择等诸环节还需做更多的探索。相信在各个环节优化的基础上,可进一步提高量子点标记免疫反应的敏感性,展现出真正的技术优势。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Alivisatos P. The use of nanocrystals in biological detec-tion[J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(1): 47-52. [本文引用:1] [JCR: 32.438]
[2] 张振亚, 梅兴国. 现代荧光免疫分析技术应用及其新发展[J]. 生物技术通讯, 2006, 17(4): 677-680. [本文引用:1]
[3] Wagner MK, Li F, Li J, et al. Use of quantum dots in the development of assays for cancer biomarkers[J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 397(8): 3213-3224. [本文引用:1] [JCR: 3.659]
[4] Qian J, Zhang C, Cao X, et al. Versatile immunosensor using a quantum dot coated silica nanosphere as a label for signal amplification[J]. Anal Chem, 2010, 82(15): 6422-6429. [本文引用:1] [JCR: 5.695]
[5] Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineer-ing of iron oxide nanoparticles for biomedical applications[J]. Biomaterials, 2005, 26(18): 3995-4021. [本文引用:1] [JCR: 7.604]
[6] Li H, Cao Z, Zhang Y, et al. Simultaneous detection of two lung cancer biomarkers using dual-color fluorescence quantum dots[J]. Analyst, 2011, 136(7): 1399-1405. [本文引用:1] [JCR: 3.969]
[7] Van Gageldonk PG, van Schaijk FG, van der Klis FR, et al. Development and validation of a multiplex immunoassay for the simultaneous determination of serum antibodies to Bordetella pertussis, diphtheria and tetanus[J]. J Immunol Methods, 2008, 335(1-2): 79-89. [本文引用:1] [JCR: 2.225]
[8] Chan WC, Nie S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J]. Science, 1998, 281(5385): 2016-2018. [本文引用:1]