引用本文
张群, 杨蕾, 曹伟峰. 实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体. 2012, 27(5): 416-418
ZHANG Qun, YANG Lei, CAO Weifeng.. Analysis of pathogen causing hand-foot-mouth disease by real-time fluorescence PCR. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 416-418  
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实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体
张群, 杨蕾, 曹伟峰
太和县中医院检验科,安徽 太和 236000

作者简介：张群,男,1974年生,主管技师,主要从事生化检验工作。

摘要

目的 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测患儿手足口病病原体,为防治手足口病提供依据。方法 收集手足口病疑似患儿189例(按年龄分为<3岁组113例、35岁组76例)及39例手足口病密切接触儿童的咽拭子、疱疹液,用FQ-PCR检测标本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA16),并与酶联免疫吸附试验(ELISA)结果进行比对。结果 189例手足口病患儿疑似组FQ-PCR检测EV阳性141例,阳性率为74.6%,其中<3岁阳性91例、35岁阳性50例,35岁组EV检出率明显低于<3岁组( P<0.05);EV71阳性135例,CoxA16阳性65例;咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161),疮疹液标本阳性率为82.1%(23/28);ELISA检测EV阳性76例(40.2%);39例手足口病密切接触者FQ-PCR检测EV阳性率为33.3%(13/39),ELISA检测阳性率为17.9%(7/39)。结论 FQ-PCR是一种特异性强、灵敏度高、检测较快速、效率高的方法,对检测手足口病病原体及进行相关流行病调研有重要价值。

关键词: 实时荧光PCR; 手足口病; 肠道病毒
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0416-03
Analysis of pathogen causing hand-foot-mouth disease by real-time fluorescence PCR
ZHANG Qun, YANG Lei, CAO Weifeng.
Department of Clinical Laboratory, Taihe Traditional Chinese Medicine Hospital, Anhui Taihe 236000, China
Abstract

Objective To detect the pathogens by real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction (FQ-PCR) and provide the reference for the prevention of hand-foot-mouth disease.Methods Throat swab and vesicle fluid were collected from 189 suspected children with hand-foot-mouth disease and 39 children with close contact to hand-foot-mouth disease patients in Anhui county and its neighborhood area. Enterovirus (EV), enterovirus 71 (EV71) and coxsakievirus A16 (CoxA16) were detected by FQ-PCR, and the results were compared with the results of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results By FQ-PCR, 141 children among the 189 suspected children with hand-foot-mouth disease were detected EV (positive rate: 74.6%), including 91 children between 0 and 3 years old and 50 children between 3 and 5 years old. EV detection rate of 3-5 years old group was obviously lower than that of 0-3 years old group ( P<0.05). There were 135 EV71 positive samples and 65 CoxA16 positive samples. The positive rate of throat swab samples was 74.5% (120/161), and that of vesicle fluid samples was 82.1% (23/28). There were 76(40.2%) EV positive samples by ELISA. The positive rate of EV in 39 children with close contact to hand-foot-mouth disease patients by FQ-PCR was 33.3%(13/39). The positive rate by ELISA was 17.9%(7/39).Conclusions FQ-PCR has high specificity, sensitivity, efficiency and speed, which contributes to its important value as detection method of pathogen causing hand-foot-mouth disease and epidemiological study.

Keyword: Real-time fluorescence polymerase chain reaction; Hand-foot-mouth disease; Enterovirus

手足口病是一种由肠道病毒(enterovirus, EV)引起的急性传染病, 具有流行性强、传染性强、传播途经复杂等特点, 多发于5岁以下婴幼儿, 可引起手、足和口腔等部位的疱疹, 有的患者还可引起心肌炎、肺水肿和无菌性脑膜炎等并发症[1]。引起手足口病的肠道病毒多达20余种(型), 但较常见的肠道病毒主要为肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)。

肠道病毒感染的实验室诊断金标准是病毒培养, 但此法不但繁琐复杂而且费时。近年来建立的传统逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR), 虽为卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年版)推荐的实验室检测方案之一, 但此法操作步骤也相对复杂, 周期较大, 且易造成污染。因此, 急需建立一种简便、快速的手足口病病原体检测方法。实时荧光聚合酶链反应(FQ-PCR)技术采用完全闭管式操作, 大大减少了扩增产物的污染机会, 比传统RT-PCR更快捷、敏感和特异, 完全能满足手足口病疫情流行时同时处理大批量标本检测之需[2]。我们采用FQ-PCR对本县及邻近县05岁疑似手足口病患儿及密切接触儿童进行检测, 以期评估此法在手足口病病原体检测上的应用价值。

材料和方法
一、 材料

1. 标本 2010年2月至10月安徽省太和县及邻近县05岁疑似手足口病患儿189例(按年龄分为< 3岁组113例、35岁组76例)及密切接触儿童39例, 其中咽拭子标本161份, 疱疹液标本28份, 用无菌棉拭采集标本, 置病毒汉格氏液保存管, 冷藏运至实验室, -20 ℃保存。诊断参照卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年)[3]。

2. 仪器与试剂 美国ABI-7300实时荧光定量PCR仪。肠道病毒通用型EV核酸检测试剂盒、肠道病毒71核酸检测试剂盒、肠道病毒柯萨奇A16核酸检测试剂盒由广州达安基因生物有限公司提供, 均为PCR-荧光探针法。酶联免疫吸附试验(ELISA)EV71 IgG及CoxA16 IgG检测试剂盒由深圳博卡生物公司提供。

二、方法

1. FQ-PCR 取200 μ L上清液, 使用Trizol法提取标本RNA, 再在扩增仪进行PCR扩增, 按说明书进行反应混合液的配制和循环参数的设置, 并同时设置梯度模板及阴性对照。结果判断按ABI-7300实时FQ-PCR及试剂盒说明书进行。

2.ELISA 严格按试剂盒操作说明书进行。

三、统计学方法

采用SPSS13.0软件录入数据后进行统计分析, 组间比较采用χ 2检验。

结 果

189例手足口病疑似患儿FQ-PCR检测EV阳性141例, 阳性率为74.6%; 其中< 3岁组阳性91例, 阳性率为80.5%; 35岁组阳性50例, 阳性率为65.8%。35岁组EV阳性率明显低于< 3岁组(P< 0.05)。EV71阳性135例, CoxA16阳性65例。咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161), 疱疹液标本阳性率为82.1%(23/28)。ELISA检测EV阳性76例, 阳性率为40.2%(76/189)。

39例手足口病密切接触儿童组FQ-PCR检测EV阳性率为33.3%(13/39), ELISA检测阳性率为17.9%(7/39)。

讨 论

手足口病是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见的传染病, 其传染性强, 传播途径复杂, 传播速度快, 短时期内可造成较大范围内的流行, 一旦流行疫情控制难度大。该病病原体为肠道病毒, 主要为EV71及CoxA16。肠道病毒感染可引起手足口病, EV71感染常有严重的神经系统并发症发生, CoxA16感染则引起自限性的手足口病, 极少发生严重并发症和死亡[5]。

近年来, 安徽省一些地区手足口病疫情有上升趋势, 而主要病原体为EV17[6]。因此, 对于出现中枢神经系统症状的患者, 急需有一种快速、特异、灵敏、高效的诊断试剂, 用于早期诊断。病毒培养法虽是诊断的金标准, 但分离培养1个周期获得阳性结果需57 d, 费时且操作繁琐, 不适宜作早期快速诊断。ELISA虽简便快速, 但一般要在发病后的12 d才能检测出抗体。RT-PCR也存在操作复杂及易污染等缺点, 且检测CoxA16不够敏感[2]。

本研究结果显示, FQ-PCR能快速、敏感、特异、高效检测手足口病病原体, 检测EV阳性率达74.6%, 而ELISA检测EV阳性率仅40.2%, 这与李金明等[7]报道基本相同。本研究还显示35岁组EV阳性率明显低于< 3岁组, 可见婴幼儿手足口病以03岁为主, 这与此段年龄婴幼儿抵抗力低对病毒易感有关。本研究EV71阳性135例, CoxA16阳性65例, 说明本县与邻近县手足口病感染以EV71为主, 其次为CoxA16。咽拭子标本阳性率为74.5%(120/161), 疱疹液标本阳性率为82.1%(23/28), 可见疱疹液的阳性率比咽拭子高, 但疱疹液标本较难采集, 而咽拭子标本较易采得, 无需抽血, 无创伤性, 儿童及家长都易接受, 因此推荐使用咽拭子标本采集方法。39例手足口病密切接触儿童FQ-PCR检测EV阳性率亦达33.3%, 说明手足口病密切接触的儿童中感染比例也较高, 提示该病病毒系经密切接触传播, 因此, 做好儿童个人卫生及幼托机构等集体场所的环境卫生以及消毒隔离工作极为重要。由此可见, 用FQ-PCR对于手足口病病原体进行早期检测, 对手足口病的诊治、及时监测、防控意义重大。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 雷永良, 陈秀英, 叶碧峰, 等. 实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用[J]. 中国病原生物学杂志, 2008, 3(10): 738-739. [本文引用:1]
[2] 许玉玲, 黄学勇, 卫海燕, 等. 实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析[J]. 中国病原生物学杂志, 2011, 24(10): 736-738. [本文引用:2]
[3] 中华人民共和国卫生部. 2008年手足口病预防控制指南[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2008, 2(3): 210-213. [本文引用:1]
[4] 王七生, 秦金勇, 蒋立立. 实时荧光PCR技术在手足口病原学检查中的应用[J]. 中国医药导报, 2011, 8(17): 90-91. [本文引用:1]
[5] 何雅青, 肖性龙, 杨洪, 等. 实时荧光RT-PCR及RT-PCR快速检测肠道病毒71型和柯萨奇A16病毒[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(12): 2780-2781. [本文引用:1]
[6] 张文艳, 金晶, 汪秀琴, 等. 合肥地区328例手足口病患儿肠道病毒实时RT-PCR检测结果分析[J]中国儿童保健杂志, 2010, 18(11): 877-879. [本文引用:1]
[7] 李金明, 熊德琴, 齐晓彤, 等. 实时荧光定量PCR在手足口病病原体检测中的应用[J]. 实验与检捡医学, 2011, 29(2): 129-130. [本文引用:1]