引用本文
林勇平, 孟艳辉, 郑卫东, 刘忠民. PCSK9基因I474V多态性与冠心病相关性的研究 . 2012, 27(5): 412-415
LIN Yongping, MENG Yanhui, ZHENG Weidong, LIU Zhongmin. Research on the correlation of PCSK9 gene I474V polymorphism with coronary artery disease . Labratory Medicine, 2012, 27(5): 412-415  
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PCSK9基因I474V多态性与冠心病相关性的研究
林勇平1, 孟艳辉2, 郑卫东3, 刘忠民1
1.广州医学院第一附属医院检验科,广东 广州 510120,2.广东省计划生育科学技术研究所,广东 广州 510080,3.广东省人民医院检验科,广东 广州 510055

作者简介：林勇平,男,1973年生,博士,讲师,主要从事临床生化与分子生物学检验工作。

通讯作者：刘忠民,联系电话：020-83062158。

基金:广东省高等学校重点扶持学科资助项目（粤教科[2007]26号）,广州市教育局市属高校科研项目（10A259）
摘要

目的 探讨人蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶9( PCSK9)基因I474V位点在冠心病(CAD)患者和健康人群中的分布特点以及与血脂水平、CAD发生、病变程度的相关性,为阐明CAD的遗传发病机理、患者危险性分级评估等提供实验依据。方法 采集经冠状动脉造影确诊的CAD患者血液标本288例,健康对照者血液标本300例,提取基因组DNA模板,应用双向等位基因特异性引物聚合酶链反应(Bi-PASA PCR)技术检测 PCSK9基因I474V多态性位点,并用基因测序法验证结果。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平用酶法测定。结果 PCSK9基因I474V 多态性位点主要以II和IV基因型存在。CAD组和对照组在I474V位点的等位基因频率、基因型频率分布差异无统计学意义( P>0.05)。CAD组和对照组之间TC、LDL-C、HDL-C水平差异具有统计学意义( P<0.05),TG水平差异无统计学意义( P>0.05)。CAD组中II和IV基因型之间TC、TG水平的差异具有统计学意义( P<0.01), HDL-C、LDL-C水平差异无统计学意义( P>0.05)。与非I474V携带者比较,I474V 携带者血TC、TG水平增高。IV基因型的冠状动脉病变支数明显高于II基因型( P<0.05)。结论 PCSK9基因I474V 多态性位点主要以II和IV基因型存在,CAD患者 PCSK9基因I474V位点的基因型与TC、TG水平升高相关联,同时与CAD病变严重程度存在一定关联。

关键词: 人蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶9; I474V多态性; 基因; 冠心病
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0412-04
Research on the correlation of PCSK9 gene I474V polymorphism with coronary artery disease
LIN Yongping1, MENG Yanhui2, ZHENG Weidong3, LIU Zhongmin1
1. Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangdong Guangzhou 510120, China
2. Guangdong Institute of Planned Parenthood Research, Guangdong Guangzhou 500800, China
3. Department of Laboratory Medicine, Guangdong General Hospital, Guangdong Guangzhou 510055, China
Abstract

Objective To investigate the distribution characteristics of the I474V loci of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 ( PCSK9) gene in coronary artery disease (CAD) patients and healthy subjects, study the correlation of blood lipid levels, the development of CAD and the severity of coronary lesions,and provide the reference to elucidate the pathogenesis and genetic risk assessment of CAD.Methods According to the results of coronary angiography, blood samples from 288 CAD patients and 300 healthy controls were collected. I474V polymorphism loci in PCSK9 gene was detected by bi-directional polymerase chain reaction (PCR) amplification of specific alleles (Bi-PASA PCR). The results were further confirmed by cycle sequencing. Serum levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were measured by enzymatic methods.Results Ⅱ and Ⅳ genotypes were dominant in the I474V polymorphism loci of PCSK9 gene. No significant difference was found in allele frequencies of I474V loci between CAD patients and healthy controls ( P>0.05). There was statistical significance in TC, LDL-C and HDL-C levels between CAD patients and healthy controls ( P<0.05), and the TG level had no statistical significance ( P>0.05). Serum levels of TC and TG ( P<0.01), but not HDL-C and LDL-C ( P>0.05) were statistically different between Ⅱ and Ⅳ genotypes in CAD patients. Subjects with I474V polymorphism of PCSK9 gene had significantly higher serum levels of TC and TG than subjects without I474V polymorphism. The number of coronary lesions was more in patients with Ⅳ genotype than Ⅱ genotype with statistical difference ( P<0.05).Conclusions Ⅱ and Ⅳ genotypes are dominant in the I474V polymorphism loci of PCSK9 gene. The genotype of PCSK9 gene I474V polymorphism is correlated with serum increasing levels of TC and TG and the severity of coronary lesions in CAD patients.

Keyword: Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; I474V polymorphism; Gene; Coronary artery disease

流行病学调查显示, 冠心病(CAD)与多种遗传因素有关, 尤其是参与脂代谢的多个基因在CAD的发生发展中起着重要作用, 血脂水平异常是造成CAD死亡率及催患率增加的主要因素。2003年发现的人蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)基因为引起常染色体显性高胆固醇血症(ADH)的第3个基因, PCSK9错义突变可引发常染色体显性高胆固醇血症, 易引起早发性心血管事件[1]。PCSK9表达的神经细胞凋亡调节转化酶-1蛋白 (neural apoptosis regulated convertase 1, NARC-1)可导致细胞表面低密度脂蛋白受体 (low-density lipoprotein receptor, LDLR) 的降解, 血液中低密度脂蛋白(LDL)可以被LDLR摄取降解, 从而使血LDL水平保持在正常水平范围内。PCSK9基因突变时会破坏其正常功能, 功能增强型使LDLR的降解加强, 从而升高血浆胆固醇, 加重CAD患者的病情, 并且能降低他汀类降血脂药物对高胆固醇血症患者的治疗效果[2]。目前国内外报道具有这种多态性位点主要有F216L、D374Y、I474V、N425S和E670G等位点[3, 4, 5]。但有关I474V位点与CAD关联性的研究报道较少。我们拟用CAD患者和健康人作为研究对象, 采用双向等位基因特异性引物聚合酶链反应(bidirectional PCR amplification of specific alleles, Bi-PASA PCR)技术观察I474V位点在2组人群中的分布情况, 并分析该位点与CAD的关系以及对血脂代谢所产生的影响。

材料和方法
一、研究对象

1. 选取2009~2011年在广州医学院第一附属医院和广东省人民医院住院CAD患者288例作为CAD组, 其中男186例、女102例, 平均年龄63± 10; 以健康对照者300名作为对照组, 其中男168名、女132名, 平均年龄64± 15, CAD组与对照组间的性别和年龄的差异均无统计学意义(P> 0.05)。

2. 纳入标准 (1)CAD组:全部CAD患者均经冠状动脉造影证实, 至少1支主冠状动脉狭窄> 50%; (2)对照组:为同期在同一医院例行健康体检的健康个体, 并经询问病史、体检及心电图、胸部X线等检查排除心血管疾病病史。排除标准:中风或短暂性脑出血发作, 癌症或当前有肾脏、甲状腺、肝脏系统疾病的。对照组检查发现有心血管及其他疾病的对象不入选。

二、主要试剂与仪器

1.试剂 血液基因组DNA 提取试剂盒; TaqDNA聚合酶; dNTP; 琼脂糖; 相对分子质量标准DNA Marker 1购自天根生化科技有限公司。

2.仪器 离心机; 微量可调移液器为Eppendorf公司产品; 水平凝胶电泳仪; 凝胶成像分析为英国Syngene公司产品; 贝克曼LX-20全自动生化分析仪为美国贝克曼公司产品; PCR分析仪为美国Applied Biosystems公司产品。

三、实验方法

1.标本采集 采集CAD患者和对照者空腹外周静脉血, 离心分离血清, 吸取血细胞500 μ L、血清1 000 μ L, 收集的样本于-80 ℃保存。

2.人外周血DNA的制备 按照DNA提取试剂盒说明书操作, 提取人外周血DNA, -20 ℃保存备用。

3.引物设计 根据GenBank 获得的PCSK9基因I474V多态性位点所在序列的信息, 设计等位基因特异性的 2 条内侧引物A和B。引物A序列为5'-GGGGGGGGGCTACACGGATGGCCACA GCCA-3', 引物B序列为5'-GGGGGGGGGCTCAT CTGGGGCGCAGCGGGCGAC-3', 其3'末端碱基分别与突变位点碱基和野生型SNP 位点碱基互补。以2条内侧引物作为约束条件, 分别设计2条外侧引物P和Q, 引物P序列为5'-GCCATCACCA TCTTTCAC-3', 引物Q序列为5'-ACACACACACA CACGAAG-3', 应用DNAMAN软件进行引物设计。

4.PCR扩增体系和条件 PCR反应总体积为25 μ L, 含DNA100 ng, TaqDNA聚合酶1.0 U、正反向引物各0.3 μ mol/L、dNTP 200 μ mol/L、10× Taq Buffer 2.5 μ L和双蒸水。PCR扩增条件为热启动, 94 ℃预变性5 min, 然后以下列温度和时间循环35次:94 ℃ 变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸 45 s。末次循环后均于72 ℃延伸5 min, 4 ℃保存。扩增结束后取3 μ L PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。

5.将PCR产物送上海英俊生物技术有限公司测序, 验证Bi-PASA PCR结果。

6.血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度等相关检测采用酶法测定。

三、统计学方法

采用直接基因计数法计算, 研究对象与Hardy-weinberg平衡的符合程度, 单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表χ 2检验, 不同人群间及不同基因型间各项血脂指标、平均年龄、冠脉病变支数的比较用两独立样本的t检验。采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。

结 果
一、CAD组和对照组PCSK9基因I474V的等位基因频率和基因型频率的比较

用Bi-PASA PCR扩增含PCSK9基因I474V位点的片段, 琼脂糖电泳图谱显示2种基因型, 基因型II者其产物条带为687、577 bp 2条条带; 基因型IV者其产物条带为687、577和130 bp 3条条带, 见图1。经Hardy-Weinberg吻合度检验, I474V位点基因型个体的观察值和期望值差异无统计学意义, 表明等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。经统计学分析, 该位点等位基因频率、基因型频率在对照组和CAD组间差异无统计学意义, 见表1。

图1 双向等位基因特异性引物PCR法扩增I474V位点所在序列的产物(注:M为DNA Marker; 1、2为II基因型; 3、4为IV基因型)

二、PCSK9基因I474V位点的测序验证

PCSK9基因I474V位点PCR扩增产物纯化后直接测序, 测序结果与GenBank中dbSNP的数据库对比。

表1 I474V等位基因和基因型频率在CAD组和正常对照组间的分布
三、对照组和CAD组的血脂水平分析

CAD组和对照组的TC、TG、HDL、LDL水平见表2。2组之间TC、LDL-C、HDL-C水平差异有统计学意义(P< 0.05)。

表2 CAD组和对照组血脂水平的比较
四、PCSK9基因I474V位点不同基因型血脂水平的分析

CAD患者各基因型间TG、TC、HDL、LDL水平见表3。II、IV基因型之间TG、TC水平差异有统计学意义(P< 0.01), LDL-C、HDL-C的差异无统计学意义(P> 0.05)。

表3 CAD患者各基因型血脂水平的比较
五、CAD组各基因型与年龄、病变支数的关系

CAD组各基因型患者的平均年龄及病变支数见表4。Ⅱ 、Ⅳ 基因型间患者的平均年龄不具有可比性, 平均病变支数的差异有统计学意义(P< 0.05)。

表4 各基因型CAD患者和年龄、病变支数的比较
讨 论

流行病学调查显示, 在导致CAD发生的众多危险因素中, 血脂水平异常是造成CAD发病率及死亡率增加的主要因素。常染色体显性高胆固醇血症是CAD的风险因子, 其公认的原因:一是LDLR基因的突变, 二是LDLR的配体蛋白-载脂蛋白B(apo B)的功能缺陷; 涉及高胆固醇血症的第3个基因则是2003年发现的PCSK9基因, 其定位于人类染色体1p32, 全长约22 kb, 含12个外显子, 编码692个氨基酸组成的神经细胞凋亡调节转化酶-1(NARC-1)蛋白。PCSK9有多种序列变异体, 这些变异与多种生理及病理过程有关。PCSK9参与肝再生和神经分化, 负调节LDLR, 并与脂质代谢、ADH和动脉粥样硬化等生物过程有关。目前国内外报道PCSK9基因的多态性位点主要有F216L、D374Y、I474V、N425S和E670G等位点[3, 4, 5]。但有关I474V位点与CAD关联性的研究国内未见报道。

I474V多态性位点位于PCSK9基因的第9外显子, 为由ATC→ GTC的杂合性突变。应用双向等位基因PCR扩增(Bi-PASA PCR)方法[6], 对PCSK9基因I474V多态性的研究表明, 健康人群和CAD患者在该位点的等位基因频率分别为对照组:0.5%(V)/99.5%(I), CAD组:0.7%(V)/99.3%(I); 基因型频率分别为对照组:1.0%(IV)/99.0%(II), CAD组:1.39%(IV)/98.61%(II)。VV基因型在本研究中尚未发现。健康人群和CAD患者的等位基因频率和基因型频率分布差异不明显; 但CAD组II与IV基因型之间的TC、TG水平以及冠状动脉平均病变支数之间的差异有统计学意义(P< 0.01、P< 0.05)。提示PCSK9基因I474V多态性与TC、TG水平升高关联, 同时与CAD病变严重程度有一定关联。Norata等[7]对意大利1 541个中年年龄CAD患者的研究发现, IV基因型频率为28.4%, VV基因型频率为3.4%。但是II基因型与IV基因型之间的所有血脂指标差异均无统计学意义, II与VV之间仅血浆TC水平差异有统计学意义(P=0.05)。Shioji等[8]在对日本人群普查中发现, PCSK9基因I474V 的多态性也使得TC水平和LDL-C 水平显著升高, 造成这种差异的原因可能与人种、性别、年龄及环境因素的差异等有关。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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