引用本文
李博, 顾大勇, 司徒博, 李政良, 颜晓慧, 刘芹兰, 郑磊, 王前. HIV-1电化学活性-非活性开关分子信标的构建及验证. 2012, 27(5): 408-411
LI Bo, GU Dayong, SITU Bo, LI Zhengliang, YAN Xiaohui, LIU Qinlan, ZHENG Lei, WANG Qian. The construction and confirmation of HIV-1 electrochemically active-inactive switching molecular beacon. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 408-411  
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HIV-1电化学活性-非活性开关分子信标的构建及验证
李博1, 顾大勇2, 司徒博1, 李政良2, 颜晓慧3, 刘芹兰1, 郑磊1, 王前1
1.南方医科大学南方医院检验医学科(系)临床快速检验实验室,广东 广州 510515
2.深圳国际旅行卫生保健中心,广东 深圳 518033
3.南方医科大学南方医院临床实验研究中心,广东 广州 510515

作者简介：李博,女,1987年生,硕士,主要从事电化学基因传感器及其临床应用研究。

通讯作者：郑磊,联系电话：02062787681。

基金:广东省科技计划国际合作项目（2008A050200006）; 广东省科技计划项目（2010A030300006）; 广东省自然基金项目（S2011010003840）; 国家质检总局科技计划项目（2011IK142）
摘要

目的 构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)电化学活性-非活性开关分子信标(CAs-MB)并验证其结构及功能。方法 合成并纯化针对HIV-1 gag基因保守区序列的CAs-MB,用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和循环伏安法(CV)验证其结构,用差分脉冲伏安法(DPV)信号强度评价CAs-MB的识别功能。结果 胭脂红酸(CA)单体与CAs-MB FT-IR图的变化证明CA已标记于MB末端,CV图证明CAs-MB电化学活性ON和OFF状态的存在。DPV结果证实其能够在电化学平台上实现对目标序列的特异性识别,且能够区分一个碱基的差异。结论 CAs-MB作为HIV-1 gag基因的特异性识别元件有望用于构建新型HIV-1电化学基因传感器。

关键词: 人类免疫缺陷病毒1型; 分子信标; 电化学基因传感器
中图分类号:R373 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0408-04
The construction and confirmation of HIV-1 electrochemically active-inactive switching molecular beacon
LI Bo1, GU Dayong2, SITU Bo1, LI Zhengliang2, YAN Xiaohui3, LIU Qinlan1, ZHENG Lei1, WANG Qian1
1. Laboratory of Point-of-care Testing,Clinical Laboratory Center,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangdong Guangzhou 510515,China
2.Shenzhen International Travel Health Care Center, Guangdong Shenzhen 518033,China
3. Research Center of Clinical Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510515, China
Abstract

Objective To construct human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) electrochemically active-inactive switching molecular beacon(CAs-MB) and confirm its structure and function.Methods CAs-MB targeted conserved region of HIV-1 gag gene was prepared and purified. The structure was confirmed by Fourier transform-infrared spectroscopy (FT-IR) and cyclic voltammetry (CV), while its function of recognizing targets was evaluated by differential pulse voltammetry (DPV).Results The variations of FT-IR spectra of free carminicacid (CA) and CAs-MB indicated that CA had covalently linked onto the ends of MB. The results of CV proved that both ON and OFF statuses of CAs-MB were existing. DPV results illustrated that CAs-MB was effective in signaling the presence of complementary target and discriminating targets in electrochemical gene biosensor that differ by a single nucleotide.Conclusions CAs-MB opens a new detective technique and can be expanded to electrochemical gene biosensor to perform HIV-1 gag gene specificity detection.

Keyword: Human immunodeficiency virus-1; Molecular beacon; Electrochemical gene biosensor

获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)自1981年在美国发现以来, 在世界范围内迅速蔓延, 已严重危害人类健康。对人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染的监测是预防和控制其传播的有效手段[1]。病毒核酸是HIV-1感染后出现最早的检测指标, 各种分子生物学方法如逆转录聚合酶链反应实验(RT-PCR)、核酸序列扩增 (NASBA)、分支DNA杂交 (bDNA)及实时荧光定量PCR等相继应用于临床。但其检测仪器、试剂昂贵, 操作复杂, 限制其在基层医疗机构及实验室的推广应用。基于核酸杂交的基因传感器由于集高效、灵敏、特异、小巧、经济等优点 [2], 为核酸检测提供一种新的快速又价廉的途径。用于基因传感器的检测技术包括荧光技术[3]、石英晶体微天平[4]、电化学发光[5]、表面等离子共振光谱[6]和电化学方法[7]等。其中电化学方法因其信号测量简便、仪器成本低等优点而引起了人们的广泛关注。

材料和方法
一、材料

CHI660D电化学工作站, 三电极体系:玻碳电极为工作电极、铂电极为对电极、银(Ag)/氯化银(AgCl)为参比电极(上海辰华公司); VERTEX70傅里叶变换红外光谱(fourier translation infrared spectroscopy, FT-IR)仪(德国Bruker公司); ALPHA冷冻真空干燥机(德国Christ实验室); HPLC 1100 (美国Agilent); Nanosep3K孔径超滤离心管(美国PALL公司); 胭脂红酸(carminic acid, CA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐[N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC]购自美国Sigma-Aldrich公司; 针对HIV-1 gag基因保守区设计两末端氨基标记的MB探针及其他核酸序列MB探针:NH2-5'GCGAGCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATG TATAGCGCTCGC 3'-NH2, 目的序列:5'-GCTAT ACATTCTTACTATTTTATTTAATCCCAG-3', 单碱基不匹配:5'-GCTATACATTCTTAATATTTTA TTTAATCCCAG-3', 双碱基不匹配:5'-GCTA TACATTCTTAATATTATATTTAA TCCCAG-3'(美国Invitrogen公司); 磷酸盐缓冲液(PBS)由0.1 mol/L KH2PO4配制, 含1.5 mol/L NaCl, pH值为7.3。

二、实验方法

1.电化学活性-非活性开关分子信标(CAs-MB)的制备 将2.0 OD的MB序列分散在376 μ L PBS缓冲液中, 加入20 μ L 1 mmol/L的CA溶液混匀。在8.0 mmol/L EDC存在的条件下, 20 ℃持续搅拌20 h(或室温下搅拌12 h)。反应结束后用孔径为3K的超滤离心管进行CAs-MB粗提纯, 然后用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)进一步纯化, 冷冻干燥, 并于4 ℃条件下保存备用。

2.CAs-MB的表征 (1)用KBr 压片法对CA进行FT-IR分析, 用以验证CA与MB序列之间的共价连接; (2)采用玻碳电极、铂丝电极、Ag/AgCl三电极体系, 用循环伏安法(cyclic voltammetry, CV)证实CA单体与CAs-MB电化学活性的差异。扫描电压范围为-0.10.1 V, 扫描速率为0.1 V/s。

3.杂交实验 杂交实验均通过将10 μ mol CAs-MB与等体积、等浓度的核酸序列共同加入杂交缓冲液中[0.1 mmol/L PBS(含1.5 mmol/L NaCl), pH值7.3], 最后将反应体系定容至200 μ L, 并对杂交反应温度、时间进行优化。反应原理见图1。用CV对CAs-MB与目的序列的杂交产物进行电化学活性测定, 通过比较CAs-MB与杂交产物的CV曲线, 验证CA二聚体是否可通过与目的序列的杂交而分离, 从而进一步证实分子信标的茎环状结构。并且通过比较CAs-MB分别与目的序列、单碱基不匹配序列、双碱基不匹配序列杂交后差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetric, DPV)信号的强度, 评价CAs-MB的识别功能。扫描电压范围为0.20.6 V, 振幅为0.05 V, 脉冲宽度0.05 s。

图1 CAs-MB反应原理示意图

结 果
一、FT-IR结果分析

如图2所示, CA在 3 366 cm-1和1 717 cm-1下的红外光谱吸收峰分别代表CA单体中羧基的-OH和C=O的伸缩振动(vO-H, vc=o)。 当CA标记于MB序列之后, 3 445 cm-1出现了酰胺结构中-NH-的弹性振动(vN-H), 峰形较尖, 且在1 649 cm-1处出现了酰胺结构中C=O的伸缩振动vC=O, 说明CA与氨基标记的MB序列间的酰胺键连接成功。

二、CV结果分析

游离状态的CA表现出准可逆的氧化还原峰(Epa1=-0.636 V, Epc1=-0.738 V)和不可逆的阳极峰(Epa2=0.456 V) , 这些现象分别与CA分子中蒽醌基团的氧化还原性质和对二苯酚基团的氧化性质相一致。当CA标记于MB序列末端后, 这些峰值均明显下降, 说明二聚体形式的CA分子电化学活性失活。与目的序列杂交反应结束后, CV显示单体CA的电活性恢复(见图3)。说明CAs-MB中CA二聚体可通过与目的序列的杂交而分离。证明CAs-MB电化学活性ON和OFF状态的存在, 说明电化学分子信标构建成功。

三、杂交反应的实验条件优化

杂交反应结果主要受反应体系的温度、温育时间等条件影响。最适合的杂交反应温度应比DNA· DNA杂交体Tm低2025 ℃, 比DNA· RNA杂交体低1015 ℃的温度为适宜温度。从峰电流-温度变化曲线 (图4)可以看出, 随着温度的增加, 杂交效率不断增加; 但当温度升高至60 ℃左右时, 杂交效率开始下降。图5显示的杂交反应信号随反应时间增加而改变情况, 在反应时间达30 min 时, 信号趋于稳定, 考虑节约检测时间因素, 选择30 min 作为传感器最佳检测时间。

图2 FT-IR分析(注:a为CA; b为 CAs-MB)

图3 反应前、后CV图

图4 峰电流-温度变化曲线

四、 CAs-MB检测特异性

CAs-MB以及CAs-MB与目的序列、单碱基不匹配序列、双碱基不匹配序列杂交后DPV信号见图6。作为对照, 检测 CAs-MB的DPV信号。结果显示在0.456V处有较微弱的氧化峰; 与目的序列杂交后, 峰电位增加5倍(峰电位左移0.08V, 这可能与标记后CA的结构变化有关); 与单碱基不匹配序列杂交的峰电位比目的序列杂交的峰电位降低60%左右, 与双碱基不匹配序列杂交的峰电位与CAs-MB相近, 说明CAs-MB能够代替传统的分子信标在电化学平台上实现对目标序列的特异性识别, 且能够区分一个碱基的差异。

图5 峰电流-时间变化曲线

图6 不同序列杂交后DPV图

讨 论

为了实现快速而又价廉的HIV-1核酸检测, 我们欲将集高效、灵敏、小巧、经济于一体的电化学基因传感器引入HIV-1的核酸检测, 构建HIV-1电化学基因传感器。识别元件的结构是影响电化学基因传感器特异性及敏感性的重要因素[8]。目前, 除了传统的线性结构以外, 最常见的探针结构当属茎环状荧光分子信标(molecular beacons, MBs), 其以高特异性、高敏感性及其能进行免分离实时监测的特点而成为最有效的探针分子[9]。但由于光学检测系统体积庞大, 价格昂贵, 维护困难, MBs已被引入电化学方法的构建, 被称为电化学分子信标(electrochemical MBs, E-MBs)[10]。CA是一种蒽醌化合物。单体形式的CA由于对二苯酚和奎宁基团的存在而表现出电化学活性(ON状态), 而其二聚体形式电化学活性则会消失(OFF 状态) [11]。因此, CA即能用来研制E-MBs的电化学活性分子, 拟构建的新型电化学分子信标称为CAs-MB, 已被报道用作凝血酶筛查[11], 而用于HIV核酸的筛查的CAs-MB还未见报道。

本研究构建了针对HIV-1 gag基因保守区的CAs-MB, 并验证其结构及其对目的序列的识别性能。FT-IR结果表明CA与氨基标记的MB序列间的酰胺键连接成功, CV结果显示CAs-MB中CA二聚体可通过与目的序列的杂交而分离。证明CAs-MB电化学活性ON和OFF状态的存在, 说明电化学分子信标构建成功。并在最佳反应条件下利用电化学方法— — DPV初步探讨CAs-MB对HIV-1 gag基因保守区序列的识别性能。证实其能够在电化学平台上实现对目标序列的特异性识别, 且能够区分一个碱基的差异。由于CA单体的电活性有限, 在后续研究中需要寻找电活性更强的标记物, 或在此基础上, 利用CAs-MB具有的电化学活性开关特性构建电化学实时PCR体系以提高检测灵敏度, 如再结合纳米材料[12](如碳纳米管、石墨烯等[13])修饰的超灵敏微型电极, 相信以CAs-MB为特异性识别元件的微型电化学基因传感器有望成为HIV-1核酸早期诊断的新方法, 为今后AIDS检测向临床POCT方向的发展奠定实验基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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