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欧阳红梅, 张芹, 翟明, 蒋雅先, 张蕾, 牛华. 昆明汉族急性脑梗死患者 vWF基因多态性研究 . 2012, 27(5): 404-407
OUYANG Hongmei, ZHANG Qin, ZHAI Ming, JIANG Yaxian, ZHANG Lei, NIU Hua.. Research on vWF gene polymorphisms in Han population patients with acute cerebral infarction Disease in Kunming . Labratory Medicine, 2012, 27(5): 404-407  
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昆明汉族急性脑梗死患者 vWF基因多态性研究
欧阳红梅, 张芹, 翟明, 蒋雅先, 张蕾, 牛华
昆明医学院附属昆华医院 云南省第一人民医院,云南 昆明650032

作者简介：欧阳红梅,女,1967年生,学士,副主任医师,主要从事血液病实验诊断工作。

通讯作者：牛华,联系电话：0871-3638431。

摘要

目的 阐明 vWF基因19内含子MspI多态性在昆明地区人群中的分布;探讨 vWF基因19内含子MspI多态性与急性缺血性脑梗死的关系。方法 收集119例急性缺血性脑梗死患者(脑梗死组)和117名昆明地区健康人(对照组),应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析 vWF基因19内含子MspI多态性。结果 昆明地区汉族人群中 vWF基因19内含子M+/M+、M+/M-和M-/M-基因型频率分别为0.034、0.470和0.496;M+和M-等位基因频率分别为0.269和0.731。脑梗死组中M+ / M+ 、M+ / M- 和M- / M- 基因型频率分别为0.059、0.286和0.655,M+等位基因和M-等位基因频率分别为0.202和0.798,其M+ / M-基因型频率低于对照组,M- / M- 基因型频率高于对照组。2组基因频率分布差异有统计学意义( P<0.05)。结论 昆明地区汉族人群中 vWF基因19内含子Msp Ⅰ酶切位点各基因型的分布与文献报道中的高加索人群差异较大,与中国地区其他民族人群也不尽相同。急性脑梗死的发生可能与 vWF 基因19 内含子MspI多态性有关。

关键词: 急性脑梗死; 血管性假性血友病因子; 基因多态性; MspI酶切位点
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0404-04
Research on vWF gene polymorphisms in Han population patients with acute cerebral infarction Disease in Kunming
OUYANG Hongmei, ZHANG Qin, ZHAI Ming, JIANG Yaxian, ZHANG Lei, NIU Hua.
Affiliated Kunhua Hospital of Kunming Medical College, the First People's Hospital of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650032, China
Abstract

Objective To clarify the distribution of the von Willebrand factor ( vWF) gene intron 19 MspI polymorphism among Han population in Kunming,and investigate the relationship of vWF gene intron 19 MspI polymorphism with acute ischemic cerebral infarction(AICI).Methods A total of 119 patients with AICI and 117 healthy controls were enrolled. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was used to determine the vWF gene intron 19 MspI polymorphism.Results Among the Han population in Kunming, the vWF gene intron 19 MspI M+/M+,M+/M-and M-/M-genotype frequencies were 0.034,0.470 and 0.496. M+ and M- allele frequencies were 0.269 and 0.731. M+/M+, M + / M-and M-/ M- genotype frequencies in AICI group were 0.059, 0.286 and 0.655,and M + and M- allele frequencies were 0.202 and 0.798, respectively. M+/M- genotype frequencies in AICI group were lower than those in control group, and M-/M- genotype frequencies were higher than those in control group. The frequencies between AICI and control groups had significant difference ( P<0.05).Conclusions The vWF gene intron 19 MspⅠ restriction site genotype distributions among Han population in Kunming are quite different comparing with Gaucasian populations,and the other ethnic populations in Kunming has some differences. Acute cerebral infarction may be associated with vWF gene intron 19 MspⅠ polymorphisms.

Keyword: Acute cerebral infarction; Von Willebrand factor; Gene polymorphism; MspI restriction site

脑梗死(cerebral infarction, CI)通常因脑动脉的主干或其皮层支固有动脉粥样硬化及各类动脉炎性血管病变导致血管腔狭窄或闭塞, 并进而发生血栓形成所致。而在血栓形成病理过程中, 血管内皮细胞损伤、血小板活化起关键的作用。

血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)是内皮细胞及巨核细胞产生的一种高相对分子质量血浆蛋白质, 具有胶原和血小板的受体, 参与血小板与胶原的黏附及血栓形成。vWF作为桥梁使血小板黏附于受损的血管内皮上增加血小板聚集。

近年来, 国内外有大量关于vWF循环水平与CI发生关系的文献报道。关于vWF基因19内含子多态性与CI的相关研究报道较少, 且由于基因多态性在不同民族、不同地区间可能存在差异, 因此, 我们调查分析了昆明地区汉族人vWF基因多态性分布及其与CI的相关性。

材料和方法
一、对象

选取2008年1月至2009年9月在云南省第一人民医院神经内科就诊的汉族初发CI患者119例, 其中男56例、女63例, 年龄42~83岁, 诊断均符合全国第4届脑血管病会议修订的诊断标准, 全部病例均经头部CT或MRI证实, 包括血栓性脑梗死、栓塞性脑梗死、腔隙性脑梗死、多发性脑梗死。对照组为117名汉族健康体检者, 其中男51名、女66名, 年龄39~84岁, 均无心、脑、肝、肾疾病, 无糖尿病、甲状腺病史, 近期无感染, 检查前10 d内无服用阿司匹林、潘生丁、肝素等影响血小板功能药物史。2组年龄及性别间差异无统计学意义(P> 0.05)。高血压的诊断及分级参照1999年世界卫生组织/国际高血压联盟(WHO-ISH)制订的高血压治疗指南; 糖尿病的诊断及分期参照中国2型糖尿病防治指南(2007版); 吸烟定义为每日均吸烟在2支以上。

二、方法

1. 试剂 血液基因组DNA小量抽提试剂盒、2× Taq聚合酶链反应(PCR) MasterMix(0.1 U/μ L Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTP, 3.0 mmol/L MgCl2) 、引物、血液DNA提取试剂盒、DNA Marker、上样缓冲液均购自上海生物工程有限公司, MspⅠ 酶(Ferments 公司), 溴化乙锭(EB)、溴酚蓝(大连宝生物工程有限公司)琼脂糖(深圳凌飞科技有限公司)。

2. 仪器 YY-Ⅲ 31CA 型水平电泳槽(北京六一仪器厂); T3 Thermo cycler 型基因扩增仪 (Biometra 公司); PCR-202B型PCR紫外透射仪(上海精科实业有限公司); UV-260型紫外分光光度计 (日本岛津公司); Jel Doc2001型凝胶成像系统(BIO-RAD, 美国)。

3. DNA提取 取空腹静脉血2 mL, 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝。按离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒说明书操作。紫外分光光度计测定DNA 浓度, 模板DNA 保存于-70 ℃备用。

4. vWF基因19内含子MspI多态性检测 引物按文献[1-3]中的引物序列合成, PCR扩增的上游引物:5'-AGGGCTAGATCAGTCACTGT GGCCCT-3'; 下游引物为:5'-TGGCCGCGAGCTCC CTCACTCCACC-3'。PCR反应体系为50 μ L, 2× PCR MasterMix 25 μ L, 上、下游引物各 1 μ L(终浓度为0.25 μ mol/L), 模板DNA 2 μ L(终浓度约为500 ng), dH2O 21 μ L。 PCR反应条件, 预变性95 ℃ 5 min, 变性95 ℃ 40 s, 退火65 ℃ 1 min, 延伸72 ℃ 1 min, 35个循环, 最后72 ℃延伸10 min, 在PCR扩增后的反应体系中, 加入适量相对应的限制性内切酶及酶切缓冲液, 置37 ℃温箱酶切过夜。酶切反应体系为30 μ L, PCR产物10 μ L, 加MspⅠ 酶1 μ L (终浓度10 U), 10× Buffer 2 μ L、灭菌水17 μ L。琼脂糖凝胶电泳分析结果。

三、统计学方法

应用SPSS 11.5统计学处理软件, 对各项数据资料进行统计学处理, 均以α =0.05作为检验水准。采用计数方法计算CI组及对照组的基因型频率和等位基因频率, 应用拟合优度卡方检验计算χ 2值和P值。CI组和对照组间的基因型相对风险率以比数比(odds ratios, OR)及95%可信区间表示。

结 果
一、PCR电泳结果分析

PCR扩增产物经限制性酶切后, 电泳显示3种带型, 即3种不同长度DNA片段, 分3种基因型M+/M- 杂合子167 bp+125 bp+59 bp+42 bp; M-/M- 纯合子167 bp+59 bp; M+/M+ 纯合子125 bp+59bp+42 bp。电泳结果见图1。

图1 vWF基因扩增产物MspⅠ 酶切后的电泳图(注:M:DNA标准分子质量; 1:M+/M+; 2:M+/M-; 3:M-/M-; 4、5:PCR产物)

二、CI组与对照组vWF基因19内含子MspI多态性基因型和等位基因频率比较

CI组与对照组vWF基因19内含子MspI多态性基因型和等位基因频率比较见表1。CI组M+/M-基因型频率低于对照组, M-/M-基因型频率高于对照组。2组基因频率分布比较, 差异有统计学意义(P< 0.05)。若M+为显性基因, χ 2值为6.165, P< 0.05, 认为CI组的MspⅠ 酶切位点多态性M+/M+和M+/M-基因型频率与对照组相比, 差异有统计学意义; 且CI组与对照组相比OR值为1.935(95%可信区间为1.1463.267)。即M+为CI的保护性因素, M-为其危险性因素。若M-为显性基因, 基因型频率在CI组和对照组中的分布差异无统计学意义(P> 0.05)。

表1 CI组与对照组vWF基因19内含子MspI多态性基因型及等位基因频率分布
三、本研究与国内外研究结果所示vWF基因19内含子MspI等位基因频率的比较

将本研究所获得的昆明地区人群vWF基因19内含子MspI等位基因频率与国内外其他相关文献[1, 2]进行比对, 发现昆明地区汉族人群等位基因频率与高加索人群差异有统计学意义(P< 0.05), 与中国其他地区的等位基因频率也有所不同。见表2。

表2 本研究与国内外其他研究[1, 2]vWF基因19内含子MspI等位基因频率频率比较
四、CI其他危险因素对vWF基因19内含子MspI多态性的影响

结果显示, 有无吸烟及糖尿病在CI患者各基因型分布频率间差异无统计学意义(P> 0.05)。有无高血压在CI患者各基因型分布频率间差异有统计学意义(P=0.000)。见表3。

注:* M+为显性基因

表3 CI组vWF基因内含子MspI多态性各基因型在CI危险因素中的比较
讨 论

vWF 基因组位于第12 号染色体短臂尖端12p12q→ 12pter区, 全长约178 kb, 由52 个外显子和51个内含子组成[4], 第28号外显子与vWF重要功能区A1、A2序列相关[5, 6]。vWF基因至少有33种多态性变化, 其中Thr789Ala(位于18号外显子, 非调节区)、19内含子多态性与血浆性vWF水平相关[3]; vWF基因调节区单核苷酸-1793、-1234、-1185、-1051位点变异与血浆vWF水平显著相关[7] 。vWF基因19内含子MspI多态性位于与Ⅷ 因子、血小板结合部位相对应的基因序列。

通过与其他研究文献[1, 2]比较发现, 昆明地区汉族人MspI+/MspI-的频率与高加索人群及我国其他地区人群等位基因频率均有差异。这种差异可能是由于地域和种族不同、环境与基因相互作用的结果, 也可能是由样本选取的标准、样本的大小、试验设计等的不同所引起, 加上我国汉族人种与国外人种存在较大差异; 同时由于中国人群高血压、CI的发病率均高于西方人群, 而血脂水平却普遍低于西方人群。昆明位于高海拔地区, 地理环境较特殊, 为进一步有效筛选CI的候选基因, 需要更多的大样本临床研究和开展遗传流行病学、分子流行病学研究及综合考虑多因素, 对基因- 基因及基因- 环境相互作用进行深入研究。

对不同人群的研究发现, vWF基因的一些多态性可能与冠心病的发生、发展有关[1, 3] 。赵新和等[8]研究发现vWF基因19内含子MspI多态性可能是冠心病的一个遗传标志, 其M-/M-基因型可能是冠心病包括心肌梗死和心绞痛的一个危险因素。

也有研究发现脑血管疾病与vWF 基因的多态性有关, 有学者[9] 认为vWF 上第2个内含子SmaⅠ 基因的多态性变化引起vWF 功能的变化可能与CI的发病有关。另一方面也有研究显示, 父母只要有一方曾经患有CI, 其后代就可以发现CI及vWF 升高的危险因素, 说明vWF 可能是CI的遗传因素之一。但已经发现vWF基因19内含子MspI多态性在除高血压外的大多数心血管疾病危险因素中的分布差异无统计学意义, 提示此多态性可能与我国人群高血压有关, 而与其他危险因素无关[10] 。但本研究发现vWF基因19内含子MspI多态性与CI发生相关, CI组的MspⅠ 酶切位点基因型分布与对照组相比, 差异有统计学意义。说明vWF基因19内含子MspI多态性可能与急性缺血性CI发病有关。CI组M-/M-基因型频率高于正常对照组, M+/M-基因型频率明显低于对照组, CI组各基因型相互比较M+ / M- 和M- / M- 基因型差异有统计学意义(P值分别为0.004和0.002)。本研究还发现, CI组中有无高血压患者比较各基因型有差异性, 有高血压组M-/M-基因型高于无高血压组, 频率分别为79.5%和43.5%。

CI是多因素所致的一类极其复杂的疾病。其发病与年龄、高血压、吸烟等多种因素有关, 常与高血压、冠心病、糖尿病在同一个体中同时存在, 是一些研究结果相对不确定的因素。目前确认的易感基因都直接或间接影响着脑血管病的危险因素或动脉粥样硬化的形成。由于脑血管病是一系列病理过程的最终结局, 很可能有多种基因共同作用影响最终表型。在单个候选基因与缺血性CI易患性关系的研究中, 国外都存在结论不一的报道, 原因可能包括:(1)对脑血管病的分型标准不统一; (2)样本数量、实验设计、技术和统计学方法不尽相同; (3)对病例和对照的选择不同; (4)各研究样本的种族、地区分布不一。这些也可以解释为什么同一基因多态性与CI表型的相关性会有不一样的结果。

综上所述, 本研究表明昆明地区汉族人群中vWF基因19内含子MspⅠ 酶切位点各基因型的分布与西方人群差异较大, 与中国其他民族人群也不尽相同。急性CI的发生可能与vWF基因19 内含子MspI多态性有关; M-/M- 基因型可能是昆明汉族人急性缺血性CI发病的一个遗传危险因素。

致谢:感谢上海交通大学附属第一人民医院检验科李莉、蔺丽慧、周娟在本文数据分析和论文写作方面给予的帮助。

The authors have declared that no competing interests exist.

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