引用本文
陈娟, 李雷, 魏红霞, 张葵. TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人载脂蛋白A5基因方法的建立及评价. 2012, 27(5): 400-403
CHEN Juan, LI Lei, WEI Hongxia, ZHANG Kui. Establishment and evaluation of fluorescence quantitation PCR with TaqMan-MGB probe for detecting apolipoprotein A5 gene. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 400-403  
Permissions
Copyright©2012, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人载脂蛋白A5基因方法的建立及评价
陈娟1, 李雷2, 魏红霞2, 张葵2
1.东南大学医学院,江苏 南京 210008
2.南京大学医学院附属南京鼓楼医院检验科,江苏 南京 210008

作者简介：陈娟,女,1981年生,硕士,主要从事糖代谢与心血管疾病关系研究。

通讯作者：张葵,联系电话：025-83105360。

基金:南京市科技发展重点项目（zkx09030）
摘要

目的 建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量聚合酶链反应(PCR),用于检测人载脂蛋白A5( apo A5)基因。方法 针对人 apo A5基因设计特异性引物和TaqMan-MGB荧光探针,以重组克隆质粒pPCR-Script-apo A5为DNA模板,在荧光定量PCR 仪上建立TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行灵敏度、重复性、特异性实验。结果 建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系( r=0.998);最低检测浓度为 103拷贝/μL;扩增效率(E)为110.2%,且重复性好。结论 成功建立检测人 apo A5基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR。该法具有较好的灵敏度、特异性及重复性。

关键词: 聚合酶链反应; 载脂蛋白A5; 2型糖尿病
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0400-04
Establishment and evaluation of fluorescence quantitation PCR with TaqMan-MGB probe for detecting apolipoprotein A5 gene
CHEN Juan1, LI Lei2, WEI Hongxia2, ZHANG Kui2
1. Medical College of Southeast University, Jiangsu Nanjing 210008, China
2. Department of Clinical Laboratory, Drum Tower Hospital Affiliated to Medical School of Nanjing University, Jiangsu Nanjing 210008, China
Abstract

Objective To establish fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) based on TaqMan-MGB probe for detecting apolipoprotein A5( apoA5)gene.Methods The assay, which was based on specific primers and TaqMan-MGB probe from apoA5 gene, was performed to reconstruct DNA fragment of pPCR-Script-apoA5. The fluorescence quantitation PCR with TaqMan-MGB probe and the standard curve were established. The sensitivity, specificity and repeatability of the TaqMan-MGB probe fluorescence quantitation PCR were determined.Results A fine linear relationship between the threshold cycle (Ct) values of the developed standard curve and the copy number of template was observed ( r=0.998). The sensitivity of the assay was 103 copies/μL, the amplification efficiency of assay was 110.2%, and the repeatability was good.Conclusions The fluorescence quantitation PCR based on TaqMan-MGB probe for detecting the apoA5 gene is successfully developed with high sensitivity,specificity and repeatability.

Keyword: Polymerase chain reaction; Apolipoprotein A5; Type 2 diabetes mellitus

载脂蛋白A5(apo A5)是2001年发现与血脂代谢相关的基因, 与血浆甘油三酯(TG)浓度呈负相关[1]。近年的研究表明, 高TG血症与2型糖尿病(T2DM)的发生发展有密切关系。我们建立了apo A5基因TaqMan-MGB荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法, 并通过临床标本的检测, 验证该方法的临床应用价值, 进一步探讨人apo A5 基因与T2DM的相关性。

材料和方法
一、材料

1.标本和质粒 人肝癌组织为鼓楼医院手术室取下的新鲜标本; 重组克隆质粒pPCR-Script-apo A5由本课题组前期构建。

2.试剂 人全血DNA抽提试剂盒购自Qiagen 公司; Trizol Reagent购自Invitrogen公司; PrimescriptTM RT试剂盒及常规PCR扩增试剂盒购自Takara公司; TaqMan-MGB荧光定量PCR扩增试剂盒购自南京骥骜公司; 琼脂糖和溴化乙锭购自Sigma 公司。

3.仪器 高速冷冻离心机(Heraeus公司); -80 ℃超低温冰箱(Thermos公司); 紫外分光光度仪计(Perkin Elmer公司); 紫外凝胶成像系统(UVP Bioimaging Systems); 核酸蛋白检测仪(Eppendorf 公司); 2720 Thermall Cycler PCR 扩增仪(Applied Biosystems 公司); stratagene MX3000p 荧光定量 PCR 仪(Stratagene公司)。

4.引物和TaqMan探针 按照GenBank中apo A5基因序列(NM: 052968), 采用Primer 5.0软件设计TaqMan引物及探针, 扩增片段长度为 109 bp, 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公共数据库Blast功能初步验证引物。引物和探针均由南京骥骜公司合成并纯化, 探针5'端标记的荧光报告基团是 FAM, 3'端标记荧光猝灭基团MGB, 见表1。

表1 引物和探针
二、方法

1.组织总RNA提取及逆转录反应体系的建立 取人肝癌组织150 mg, 用Trizol 抽提总RNA。逆转录反应体系10 μ L:5× PrimeScript Buffer 2 μ L, PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μ L, Oligo dT Primer(50 μ mol/L)0.5 μ L, Random 6 mers(100 μ mol/L)0.5 μ L, Total RNA 100 ng, 加RNase Free dH2O到10 μ L。反应条件:37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。

2.人全血DNA的提取 取人全血400 μ L, 用人全血DNA提取试剂盒提取DNA, 用核酸蛋白检测仪检测DNA含量及纯度。

3.普通 PCR 反应体系的建立 反应体系50 μ L:10× PCR Buffer 5 μ L, Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L, MgCl2(25 mmol /L) 3 μ L, dNTP(2.5 mmol/L) 4 μ L, 模板DNA 2.5 μ L, 20 μ mol/L上下游引物各1 μ L, 加灭菌蒸馏水到50 μ L。反应条件:94 ℃预变性 5 min; 94 ℃ 30 s, 从 65 ℃ 30 s开始每个循环降1℃到 58 ℃, 72 ℃ 30 s, 7个循环, 接下来23个循环为94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s; 末次循环后 72 ℃延伸7 min, 扩增完毕后取 5 μ L进行10 g/L琼脂糖电泳观察结果。

4. 实时荧光定量PCR反应体系的建立 反应体系为:10 μ mol/L引物各2 μ L, 20 μ mol/L探针 1 μ L, 模板 DNA 2 μ L, 2× HoTaq PCR reaction Mix 10 μ L, 加灭菌蒸馏水至终体积20 μ L。反应条件:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s 共40个循环。在扩增结束后按同一条件分析数据, 确定各标本的阈值循环数(threshold cycle, Ct)。

5.重组克隆质粒浓度测定及标准曲线的建立 重组克隆质粒用TE液连续10倍稀释至108~103拷贝/μ L作为标准品模板, 以灭菌蒸馏水为阴性质控品, 以人肝癌组织cDNA样品为阳性质控品。用上述荧光定量 PCR 反应体系进行扩增, 以浓度的对数和相应的Ct值分别为X、Y轴制作标准曲线, 计算相关系数(r) 。

6.研究对象 (1)T2DM组:2011年5月至7月南京市鼓楼医院收治的T2DM患者100例, 男55例, 女45例, 年龄(60± 15)岁, 均符合2011年美国糖尿病学会(ADA)的糖尿病诊断标准[2]; (2)健康对照组:门诊健康体检者100名, 男、女各50名, 年龄(57± 9)岁, 均排除心脑血管病变、糖尿病、肾病、肿瘤及免疫系统疾病等, 且TG≤ 1.7 mmol/L, 胆固醇(TC)≤ 6.1 mmol/L。研究对象均禁食12 h后, 清晨空腹用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集静脉血2 mL, 放置-20 ℃冰箱备用。

三、统计学方法

采用 SPSS 17.0 统计软件完成。计量资料用 x-± s表示, 组间差异性比较用t检验。所有指标均用Shapiro-Wilk检验法进行正态性检验, 非正态分布的指标取自然对数正态化后进行分析。用Levene法进行方差齐性检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、引物特异性鉴定

普通PCR扩增结果表明, 重组克隆质粒、人肝癌组织、正常人全血标本在109 bp处均出现目的条带, 且条带单一, 而灭菌双蒸水无扩增。证明设计的引物符合PCR检测反应特异性的要求, 见图1。

图1 普通PCR电泳图(注:M为DNA marker; 1为apo A5重组克隆质粒; 2为人肝癌组织; 3为正常人全血标本; 4为灭菌双蒸水)

二、标准曲线的建立及线性检测范围

用浓度为108~103拷贝/μ L的6个标准品, 分别做荧光定量 PCR。不同浓度人apo A5标准品扩增曲线见图2。标准曲线方程为Y=-3.100X+44.52。其中Y代表Ct值, X代表模板量的对数值, r为0.998。其线性范围可达6个数量级, 扩增效率(E)=101/3.100-1 =110.2%, 见图3。

图2 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人apo A5扩增曲线图

图 3 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人apo A5标准曲线图

三、灵敏度

将已定量的标准品10倍稀释至浓度极限100拷贝/μ L, 分别用建立的普通PCR方法及荧光定量PCR方法检测灵敏度。普通PCR的灵敏度为104拷贝/μ L, 而荧光定量PCR检测灵敏度可达103拷贝/μ L。

四、重复性

对108、106、103 3种不同浓度的质粒重复检测3次, 3种浓度质粒检测结果的Ct值变异系数(CV)分别为0.56%、0.06%、1.15%, 均在合理范围内。结果显示, 本研究建立的方法重复性良好。

五、特异性

用已建立的检测方法同时分析重组克隆质粒、人肝癌组织、正常人及T2DM患者全血标本提取的DNA以及灭菌双蒸水。灭菌双蒸水未出现特异性扩增曲线。说明本研究建立的方法具有高度的特异性。

六、临床标本的检测

T2DM 组的apo A5 DNA 水平明显低于健康对照组(P< 0.01); 男、女T2DM患者apo A5 DNA水平也分别低于同性别健康体检者(P均< 0.01); 健康对照组不同性别间apo A5 DNA水平差异无统计学意义(P> 0.05)。见表2。

表2 T2DM组与健康对照组apo A5 DNA水平的比较
讨 论

人apo A5基因是位于11号染色体长臂q23区, 与Apo A1/C3/A4基因簇相距约30 kb, 全长1 889 bp, 相对分子质量约39 000, 编码366个氨基酸。人apo A5在分布上具有高度的组织特异性, 特异表达于肝脏组织中[3]。目前, 临床上主要通过酶联免疫吸附试验(ELISA)从蛋白水平检测人血清apo A5浓度, 但其步骤复杂, 操作繁琐, 且耗时长, 不符合临床快速检测的需求。普通PCR方法从基因水平上检测人apo A5基因, 但灵敏度、特异性、结果分析直观性等都不及TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。

TaqMan-MGB荧光定量PCR方法学建立的关键是要有稳定的标准品, 为保证所建立方法的准确性和可靠性, 本研究用重组克隆质粒作为标准品, 提高检测的准确性及稳定性。结果显示, 利用本研究所设计的引物和探针建立的扩增体系, 灵敏度较高, 最低检测限为103拷贝/μ L, 具有良好的稳定性和重复性。线性范围广, 达6个数量级(108~103拷贝/μ L), 可以比较准确地测定人apo A5基因表达。本研究方法既有传统TaqMan探针的特点, 又具有一些新的优点如提高信噪比, 没有背景荧光, 且有更高的淬灭效率等[4]。

近年来, 不同国家对不同种族人群研究提示, apo A5基因表达异常可能与血脂代谢异常相关疾病如冠心病、糖尿病、脑梗塞等相关[5, 6, 7]。本研究利用建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法, 从外周血中分离、提纯, 快速, 准确的定量检测出T2DM组与健康对照组apo A5基因的DNA水平。结果显示T2DM组apo A5 DNA水平明显低于健康对照组(P< 0.01), 与以往研究[8, 9]结果一致。因此, 快速检测apo A5 DNA水平可为T2DM患者的临床诊治提供参考。

综上所述, 本研究建立的人apo A5基因TaqMan-MGB荧光定量 PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好、线性范围广、快速、简便, 为深入研究人apo A5基因提供了一种可选择的方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Pennacchio LA, Olivier M, Hubacek JA, et al. An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J]. Science, 2001, 294(5540): 169-173. [本文引用:1]
[2] American Diabetes Association. Executive summary: stand ards of medical care in diabetes-2011[J]. Diabetes Care, 2011, 34(Suppl 1): S4-S10. [本文引用:1]
[3] Van der Vliet HN, Sammels MG, Leegwater AC, et al. Apolipoprotein A-V: a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration[J]. J Biol Chem, 2001, 276(48): 44512-44520. [本文引用:1]
[4] Lew AE, Bock RE, Molloy JB, et al. Sensitive and specific detection of proviral bovine leukemia virus by 5' Taq nuclease PCR using a 3' minor groove binder fluorogenic probe[J]. J Virol Methods, 2004, 115(2): 167-175. [本文引用:1]
[5] Cabre A, Lazaro I, Girona J, et al. The APOA5-1131 T>C variant enhances the association between RBP4 and hypertriglyceridemia in diabetes[J]. Nutr Metab Cardiovas Dis, 2010, 20(4): 243-248. [本文引用:1]
[6] 张葵, 邱方, 李雷, 等. 脑梗死患者载脂蛋白A5基因多态性与颈动脉粥样硬化程度的相关性研究[J]. 检验医学, 2008, 23(5): 504-508. [本文引用:1]
[7] Hyun YJ, Jang Y, Chae JS, et al. Association of apolipoprotein A5 concentration with serum insulin and triglyceride levels and coronary artery disease in Korean men[J]. Atherosclerosis, 2009, 205(2): 568-573. [本文引用:1]
[8] 张葵, 魏红霞, 李雷, 等. 2型糖尿病患者检测血清载脂蛋白A5的价值[J]. 临床检验杂志, 2009, 27(6): 467-469. [本文引用:1]
[9] 李灵芳, 谷春芳. 载脂蛋A5与2型糖尿病合并冠心病相关性分析[J]. 河北中医, 2010, 32(5): 783-786. [本文引用:1]