引用本文
杨慧敏, 黄林, 覃蒙斌, 钟月圆, 刘晓春, 杨小丽. 曲古抑菌素A对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响及机制研究. 2012, 27(5): 371-373
YANG Huimin, HUANG Lin, QIN Mengbin, ZHONG Yueyuan, LIU Xiaochun, YANG Xiaoli. Influence of trichostatin A on cell apoptosis in nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells and its mechanism. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 371-373  
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曲古抑菌素A对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响及机制研究
杨慧敏1, 黄林2, 覃蒙斌2, 钟月圆2, 刘晓春3, 杨小丽2
1.上海达安医学检测中心,上海 201203
2.广西医科大学医学科学实验中心,广西 南宁530021
3.广西壮族自治区人民医院,广西 南宁 530021

作者简介：杨慧敏,女,1972年生,硕士,主管技师,主要从事实验室相关诊断研究。

通讯作者：杨小丽,联系电话：0771-5358634

摘要

目的 探讨曲古抑菌素A(TSA)对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响及作用机制。方法 以不同浓度(300、400、500 nmol/L)TSA作用鼻咽癌CNE2细胞株,采用流式细胞术测定TSA作用前后鼻咽癌细胞凋亡情况;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析TSA作用后鼻咽癌细胞中细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)表达的变化。结果 以300、400、500 nmol/L TSA分别诱导CNE2细胞凋亡,作用24 h后凋亡率分别为12.52%±1.57%、19.69%±3.00%、19.63%±2.68%; 48 h后凋亡率为24.50%±4.45%、36.24%±3.92%、34.82%±6.45%;与对照组(0 nmol/L TSA)比较,差异均有统计学意义( P<0.05)。RT-PCR检测发现,TSA可诱导CNE2细胞内 p21基因表达明显增加( P<0.01)。结论 TSA能明显诱导CNE2细胞凋亡,其作用机制可能与 p21基因的异常表达有关。

关键词: 曲古抑菌素A; CNE2细胞系; 凋亡; p21基因
中图分类号:R446.63 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0371-03
Influence of trichostatin A on cell apoptosis in nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells and its mechanism
YANG Huimin1, HUANG Lin2, QIN Mengbin2, ZHONG Yueyuan2, LIU Xiaochun3, YANG Xiaoli2
1. Shanghai Da'an Medical Centre for Clinical Laboratory, Shanghai 201203, China
2. Medical Scientific Research Center,Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021, China
3. The People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guangxi Nanning 530021, China
Abstract

Objective To investigate the influence of trichostatin A (TSA) on cell apoptosis in nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells and its mechanism.Methods CNE2 cells were incubated with TSA at different concentrations (300, 400 and 500 nmol/L). The effects of TSA on cell apoptosis were detected by flow cytometry. The expression of cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (P21) was analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results The apoptosis rates with different concentrations of TSA (300, 400 and 500 nmol/L) were 12.52%±1.57%,19.69%±3.00% and 19.63%±2.68% after 24 h treatment. The apoptosis rates were 24.50%±4.45%,36.24%±3.92% and 34.82%±6.45% after 48 h treatment. There were statistical significance compared with those of controls (0 nmol/L TSA, P<0.05). The expression level of p21 increased after TSA treatment ( P<0.01).Conclusions TSA markedly induces CNE2 cell apoptosis. Its mechanism would be related with the abnormal expression of p21 gene.

Keyword: Trichostatin A; CNE2 cell line; Apoptosis; p21 gene

鼻咽癌是中国南方常见恶性肿瘤之一, 研究有效治疗鼻咽癌的药物具有重要意义。曲古抑菌素A (trichostatin A , TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂, 能特异地抑制组蛋白去乙酰化, 改变染色体结构, 抑制细胞增殖, 诱导肿瘤细胞分化或凋亡, 是一种具有广泛应用前景的抗肿瘤药物[1]。我们以人鼻咽癌细胞系CNE2为研究对象, 观察TSA对鼻咽癌细胞的凋亡影响, 并初步探讨其抗癌作用机制。

材料和方法
一、仪器与试剂

CO2培养箱(美国Former公司); Thermo Multiskan MK3 酶标仪、FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司); 电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司); TSA(美国Cell signaling公司); RPMI1640、胎牛血清(北京Hyclone公司); Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(美国Bipec公司); 甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司); 胰酶 、Trizol 、SuperScriptⅡ 反转录酶(美国Invitrogen公司), 引物由上海生工合成; 人鼻咽癌CNE2细胞株购于湘雅医学院细胞中心。

二、细胞株及培养

人鼻咽癌CNE2细胞株在含10%胎牛血清的RPM1640完全培养基中于37 ℃ 5%CO2培养箱内培养, 生长到80%融合备用。

三、流式细胞仪分析CNE2细胞凋亡

将CNE2细胞接种于25 mL培养瓶中, 细胞分别给予300、400、500 nmol/L TSA处理24 h; 空白对照组加入与试验组药物等量的生理盐水。收集试验组与空白对照组CNE2细胞, 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次; 加入500 μ L Binding Buffer悬浮细胞; 加入5 μ L Annexin V-FITC, 混匀后避光5 min, 加入10 μ L PI, 混匀后避光10 min; 30 min内完成流式细胞仪检测细胞凋亡。TSA试验浓度的选择主要参考了相关文献[2, 3], 该试验浓度下TSA对正常(非肿瘤)细胞无毒性。

四、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21) mRNA表达

收集空白、300、400 nmol/L TSA处理24 h的CNE2细胞, 按Trizol法提取总RNA, -70 ℃保存备用。 反转录合成cDNA, 扩增。PCR反应条件如下:95 ℃ 4 min、1个循环; 94 ℃ 45 s、53 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s, 25个循环; 最后72 ℃延伸10 min。产物1.7%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统检测。引物P21(产物318 bp):5'- ATTAGCAGCGGA ACAAGGAGTCAGACAT-3'、 5'-CTGTGAAAGACA CAGAACAGTACAGGGT-3'; 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(产物502 bp):5'-CAAGGTCATCCA TGACAACTTTG-3'、5'-GTCCACCACCCTGTTGCT GTAG-3'。

五、统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行统计, 组间比较采用单因素方差分析, 检验水准α =0.05。

结 果
一、不同浓度TSA对CNE2细胞凋亡影响

以300、400、500 nmol/L TSA分别作用CNE2细胞24和48 h后, CNE2细胞凋亡率明显高于同一时间点的对照组(0 nmol/L TSA组)(P< 0.05), 见表1。

表1 不同浓度TSA作用不同时间对CNE2细胞凋亡的影响
二、TSA对鼻咽癌CNE2细胞P21表达影响

以300、400 nmol/L TSA作用CNE2细胞24 h。与对照组比较, p21 mRNA表达增加, 且增加量与TSA浓度呈正比, 见图1。0、300、400 nmol/L TSA的P21/GAPDH灰度分别为1.77± 0.11、2.79± 0.16、3.28± 0.12, 各组间差异有统计学意义(P< 0.01)。

图1 TSA处理24 h后对p21基因表达的影响(注:1为Marker; 2为0 nmol/L TSA; 3为300 nmol/L TSA; 4为400 nmol/L TSA)

讨 论

组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一。真核细胞内组蛋白乙酰化酶(histone acetylase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性的动态平衡控制着染色质结构和基因的表达。他们的功能紊乱是肿瘤发生、发展的重要分子机制。有研究发现, 抑制HDAC的活性能够引起细胞中乙酰化组蛋白的堆积, 达到抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化或凋亡的目的[4]。TSA 是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂, 有研究显示TSA可以抑制多种肿瘤细胞的生长并诱导凋亡[5, 6, 7]。本研究结果显示TSA具有诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用; 进一步研究表明TSA 对CNE2细胞的凋亡作用可能是通过调控p21基因的表达起作用的。

p21基因是肿瘤抑制基因。p21 基因的表达产物P21蛋白属于细胞周期抑制蛋白[8]。P21可与几乎每一个细胞周期素-细胞周期素依赖性蛋白激酶(Cyclin-CDK)复合物结合, 广泛地抑制各种Cyclin-CDK复合物, 从而能诱导细胞周期的停止。已有研究证明, p21的过表达可使细胞周期阻滞于G1/G0期、G2/M期或S期, 其作用的机制也不同[9]。如果DNA损伤发生在S期之前, P21蛋白通过与Cyclin-CDK结合使DNA复制受抑制; 而发生在S期的损伤, P21蛋白主要通过与增殖细胞核杭原(PCNA)结合抑制DNA合成[10]。此外, P21与细胞凋亡关系密切, 其对细胞凋亡的影响众说不一, 目前尚在研究中。多数情况下, P21具有抑制凋亡的作用, 但在某些条件下, 该基因的过表达具有促凋亡的作用[9]。本研究结果显示, P21在TSA诱导的鼻咽癌细胞中可能起到促凋亡的作用。

蛋白乙酰化与肿瘤的发生密切相关, 但其确切的作用机制不十分明确。蛋白乙酰化作用在鼻咽癌的发生、发展中的机制更是知之甚少。本研究结果提示, 高乙酰化水平有助于抑制鼻咽癌细胞的生长, 其抑制作用与细胞周期阻滞、凋亡相关, 基因表达研究显示该作用涉及肿瘤抑制基因p21的异常表达。这些结果为进一步了解鼻咽癌的发病机制, 为以后的防治研究和寻找新的治疗靶点打下很好的基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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