引用本文
蔡蓓, 冯伟华, 李立新, 王兰兰. 流式细胞术分析神经系统疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群. 2012, 27(5): 364-370
CAI Bei, FENG Weihua, LI Lixin, WANG Lanlan.. Flow cytometry application in analyzing T lymphocyte subsets of cerebrospinal fluid in patients with neural systemic diseases. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 364-370  
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流式细胞术分析神经系统疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群
蔡蓓, 冯伟华, 李立新, 王兰兰
四川大学华西医院实验医学科,四川 成都 610041

作者简介：蔡 蓓,女,1978年生,博士,主管技师,主要从事细胞免疫调节效应研究。

通讯作者：王兰兰,联系电话：028-85422751。

基金:高等学校博士学科点专项教育部博士点专项科研基金资助项目（20090181110026）; 新教师基金课题资助项目（20090181120099）
摘要

目的 用流式细胞术分析脑脊液中T淋巴细胞及其亚群,探讨不同类型神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞亚群百分率差异,寻找在疾病诊断和治疗监测中有意义的实验室检测指标。方法 采用流式细胞术测定神经系统疾病患者脑脊液和外周血T淋巴细胞亚群。结果 采用流式细胞术分析脑脊液中T淋巴细胞亚群时,运用侧向散射光(SS) vs.CD45能更准确的确定淋巴细胞群;但流式细胞术只适用于检测神经系统免疫相关疾病患者脑脊液中T淋巴细胞亚群,不适用于分析神经系统变性疾病患者。中枢神经系统炎性疾病和脊髓炎患者脑脊液中CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞百分率最高,脱髓鞘疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群百分率最低,但各类神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞百分率无明显差异( P>0.05)。细菌性脑膜炎患者脑脊液中CD3+T淋巴细胞和CD3+CD4+T淋巴细胞百分率最高,明显高于脱髓鞘疾病患者( P=0.032),但与病毒性脑膜炎患者比较差异无统计学意义( P>0.05)。各类神经系统疾病患者脑脊液中CD4/CD8比值明显高于外周血,其中细菌性脑膜炎和脊髓炎患者脑脊液中CD4/CD8比值最高,脱髓鞘疾病脑脊液中CD4/CD8比值最低,但差异均无统计学意义( P>0.05)。脑脊液IgG生成指数与脑脊液中CD3+CD4+T淋巴细胞百分率有一定相关性( r=0.324, P=0.032)。结论 流式细胞术分析神经系统炎性疾病较脑脊液常规检测具有优势,敏感性更高,可同时分析脑脊液免疫状况。流式细胞术分析在神经系统相关炎性疾病具有重要意义, CD3+CD4+T淋巴细胞高百分率与神经系统炎性疾病密切相关。但流式细胞术对于神经系统变性疾病的临床应用有限。

关键词: T淋巴细胞亚群; 流式细胞术; 神经系统疾病; 脑脊液
中图分类号:R392.12 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0364-07
Flow cytometry application in analyzing T lymphocyte subsets of cerebrospinal fluid in patients with neural systemic diseases
CAI Bei, FENG Weihua, LI Lixin, WANG Lanlan.
Department of Clinical Laboratory, West China Hospital of Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041, China
Abstract

Objective To analyze T lymphocyte and its subsets in cerebrospinal fluid (CSF) by flow cytometry (FCM), investigate the difference of T lymphocyte subset percentages in CSF of patients with different neural systemic diseases, and find the significant indicators in diagnosis and treatment monitoring.Methods The T lymphocyte subsets in peripheral blood and CSF were determined in patients with neural systemic diseases.Results Making plots based on side scatter (SS) vs. CD45 was more accurate to define lymphocytes in CSF by FCM. FCM was only suitable for analyzing lymphocyte subsets in neural systemic immune diseases. The percentages of CD3+T lymphocytes, CD3+CD4+T lymphocytes and CD3+CD8+T lymphocytes in CSF of patients with inflammatory diseases of central nervous system or myelitis were the highest, those in patients with demyelinating diseases were the lowest. There was no significant difference in the percentage of T lymphocyte subsets of CSF among kinds of neural systemic diseases( P>0.05). The percentages of CD3+T lymphocytes and CD3+CD4+T lymphocytes in CSF from patients with bacterial meningitis were higher than those in patients with demyelinating diseases ( P=0.032), and there was no statistical significance with those in patients with viral meningitis( P>0.05). The ratios of CD4/CD8 were significantly higher in CSF in all kinds of neural systemic diseases than those in peripheral blood. The ratio in CSF was the highest in patients with bacterial meningitis and myelitis, and was the lowest in demyelinating diseases with no statistical significance( P>0.05). The correlation coefficient ( r) was 0.324 between CSF IgG production index and the percentage of CD3+CD4+T lymphocytes in CSF ( P=0.032).Conclusions FCM for T lymphocyte subset analysis in inflammatory neural systemic diseases is more sensitive and helpful in analyzing the immune status of CSF than CSF routine examination. High percentage of CD3+CD4+T lymphocytes is closely related with neural systemic inflammatory diseases, but it is limited for FCM application in neurodegenerative diseases.

Keyword: T lymphocyte subset; Flow cytometry; Neural systemic disease; Cerebrospinal fluid

流式细胞术实现了高通量、快速、多参数和单细胞分析。目前该技术已广泛用于细胞免疫学的检测, 但是长期以来该方法主要限于外周血中各类淋巴细胞分析。神经系统疾病通常伴有脑脊液异常, 脑脊液分析是神经系统疾病诊断和治疗监测中直接、有效且经典的实验室检测项目。目前临床常用的脑脊液实验室检测指标主要包括脑脊液生化和脑脊液常规检测, 对于脑脊液的细胞免疫学研究较少。我们尝试用流式细胞术检测脑脊液中的T淋巴细胞及其亚群, 进一步探讨不同类型神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞及其亚群百分率的差异, 寻找在疾病诊断和治疗监测中有意义的实验室指标。

材料和方法
一、研究对象

选择2010年5月至12月四川大学华西医院因神经系统疾病住院的患者70例, 其中男48例、女22例, 年龄13~74岁。根据病理变化主要分为炎性疾病、脱髓鞘疾病和变性疾病, 其中中枢神经系统炎性疾病25例[细菌性脑膜炎11例(包括化脓性脑膜炎5例和结核性脑膜炎6例)、病毒性脑炎14例; 男17例, 女8例, 年龄20~72岁]、脊髓炎11例(男7例, 女4例, 年龄1763岁)、脱髓鞘疾病11例(多发性硬化5例、格林-巴利综合症6例; 男7例, 女4例, 年龄23~70岁)、神经系统变性疾病14例(周围神经病7例、运动神经元病6例、帕金森氏病1例; 男11例, 女3例, 年龄32~70岁)、其他神经系统疾病9例(肾上腺脑白质营养不良1例、脑肿瘤3例、脑梗死5例; 男6例, 女3例, 年龄13~74岁)。患者基本信息见表1。

表1 患者基本特征信息
二、主要试剂及仪器

鼠抗人CD45-APC抗体(克隆号:2D1), BD Tritest CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP三色荧光标记鼠抗人抗体(克隆号:SK3/SK1/SK7), BD FastImmuneTMIgG1-FITC/IgG1-PE/CD3 Isotype Control同型对照抗体; BD FACSTM Lysing Solution溶血剂; 采用BD FACSCanto 流式细胞仪检测, BD FACSDiva软件分析数据。以上试剂及仪器均由美国BD公司提供。

三、样本采集、前处理及标记

用临床常规送检脑脊液样本2~3 mL, 于3 h内处理和分析。500× g离心5 min, 弃去上清液, 留取沉淀。沉淀中加入磷酸盐缓冲液(PBS)混匀, 调整细胞浓度不超过1× 106细胞/mL, 吸取50 μ L脑脊液至流式细胞分析试管, 加入3 μ L CD45-APC抗体和5 μ L CD4-FITC/ CD8-PE/CD3-PerCP抗体, 混匀后室温避光反应30 min, 再加入200 μ L PBS, 混匀后上机检测。若为血性脑脊液则采用BD FACSTM Lysing Solution溶血剂1 mL溶血, 静置10 min后500× g离心5 min, 弃上清后加入200 μ L PBS重悬, 上机检测。所有脑脊液样本均在采集当天完成实验室检测。

四、流式细胞术检测方案建立

1. 脑脊液中淋巴细胞群的确定 采用侧向散射光(SS)vs.CD45-APC或前向散射光(FS)vs.CD45-APC双参数散点图确定淋巴细胞群, 见图1。在以单个核细胞增加为主的脑脊液样本中, 2种参数散点图具有相似的分析结果。图1(a)和(b)显示采用SS vs.CD45-APC或FS vs.CD45-APC双参数散点图确定淋巴细胞群相同, 即P1门内确定的细胞群与P2门内确定的细胞群相同。但对中性粒细胞和单个核细胞均增加的脑脊液样本, FS vs.CD45-APC散点图P2中所圈定的靶细胞群包括了SS vs. CD45-APC散点图的中性粒细胞群(P1门外的细胞)和淋巴细胞群(P1门内细胞)。因此, SS vs.CD45-APC散点图能更准确的确定脑脊液中淋巴细胞群(P1门圈定的细胞群)。针对图1中细胞群分析可发现其具有高百分率的CD3+T淋巴细胞。

图1 流式细胞术分析脑脊液中T淋巴细胞群

2. 检测电压和荧光补偿的确定 应用同型对照抗体确定检测电压, 用于排除荧光标记过程中的非特异性染色, 进行适当荧光补偿以防止不同荧光通道之间检测信号的干扰, 确定检测方案。

3. 外周血T淋巴细胞亚群检测 应用临床常规检测方案同步分析其中26例患者外周血中T淋巴细胞亚群百分率, 包括中枢神经系统炎性疾病患者14例、脱髓鞘疾病患者5例、神经系统变性疾病患者1例、脊髓炎患者4例和其他神经系统疾病患者2例。

五、统计学方法

所有数据应用SPSS13.0统计分析软件进行分析。正态分布数据采用 x-± s表示, 采用成组t检验或配对t检验进行2组间比较, ANOVA进行多组间比较, Tamhane's T2法进行组间两两比较; 非正态分布数据采用中位数(范围)表示, 采用Mann-Whitney U进行2组间比较, Kruskal-Wallis Test进行多组间比较, Nemenyi法进行组间两两比较。采用Pearson相关系数描述数据间相关性。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞亚群分析

流式细胞术对不同类型神经系统疾病患者脑脊液中淋巴细胞群的检出率不同。14例神经系统变性疾病患者有12例(85.71%)脑脊液中未检测到明显的淋巴细胞群, 仅2例(14.29%)患者脑脊液中检测到明显的淋巴细胞群(此2例患者IgG合成率和脑脊液常规检查均无异常)。25例中枢神经系统炎性疾病患者中有20例(80.00%)、11例脊髓炎患者中有8例(72.73%)、11例脱髓鞘疾病患者中有8例(72.73%)、9例其他神经系统疾病患者中有6例(66.67%)脑脊液中均可检测到明显的T淋巴细胞亚群。因此, 采用高通量流式细胞术检测脑脊液淋巴细胞亚群主要适用于神经系统免疫异常相关疾病, 在神经系统变性疾病的使用中具有局限性。

表2结果显示, 中枢神经系统炎性疾病和脊髓炎患者脑脊液中CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞百分率最高, 脱髓鞘疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群百分率最低, 但各类神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞百分率均无明显差异(P> 0.05)。进一步对中枢神经系统炎性疾病进行分类, 化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、病毒性脑膜炎患者脑脊液中CD3+T淋巴细胞和CD3+CD4+T淋巴细胞百分率依次递减, 但差异无统计学意义(P均> 0.05); 细菌性脑膜炎患者明显高于脱髓鞘疾病患者(P=0.032)。脱髓鞘疾病中格林-巴利综合症患者脑脊液CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞表达率均高于多发性硬化患者, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。见表2。

分析各类神经系统疾病患者的脑脊液CD4/CD8比值, 其中化脓性脑膜炎患者最高, 脊髓炎患者次之, 脱髓鞘疾病患者最低, 病毒性脑膜炎患者居中, 但是各组间差异均无统计学意义(P> 0.05), 见表2。

二、各类神经系统疾病患者外周血及脑脊液中T淋巴细胞亚群分析

各类神经系统疾病患者脑脊液中CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞百分率和CD4/CD8比值均较外周血明显增加(P值分别为0.000、0.000、0.002), 但CD3+CD8+T淋巴细胞表达率较外周血降低(P=0.196), 见图2(a)。进一步采用散点图分析外周血与脑脊液中CD4/CD8比值结果, 80%脑脊液样本的CD4/CD8比值高于外周血; 20%脑脊液样本低于或等于外周血, 其中化脓性脑膜炎2例、神经系统变性疾病1例、脑梗死1例、脑肿瘤患者1例、格林-巴利综合症1例, 见图2(b)。

三、脑脊液临床常规检测及脑脊液IgG合成率与脑脊液T淋巴细胞亚群百分率间相关性分析

流式细胞术分析脑脊液淋巴细胞亚群的检出率为65.3%, 明显高于传统的脑脊液常规检测的异常率(32.86%)(P=0.000)。脑脊液常规异常患者脑脊液CD3+T淋巴细胞百分率明显高于脑脊液常规正常患者(P< 0.05), CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞百分率稍增高, CD4/CD8比值稍降低, 但2组比较差异均无统计学意义(P值分别为0.019、0.07、0.096、0.678)。见表2。2组患者外周血中T淋巴细胞亚群百分率相似。

与IgG合成率正常患者比较, IgG合成率异常患者的脑脊液CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞百分率虽稍增高, CD4/CD8比值稍降低, 但差异均无统计学意义(P> 0.05)。

IgG生成指数与脑脊液中CD3+CD4+T淋巴细胞表达率有一定相关性(r=0.324, P=0.032), 见图2(c); 其他T淋巴细胞亚群百分率与IgG合成率或生成指数间均无相关性。

表2 各类神经系统疾病患者脑脊液中T淋巴细胞亚群分析

图2 神经系统疾病患者脑脊液、外周血中T淋巴细胞亚群百分率及脑脊液检测常用临床指标间的相关性分析

讨 论

目前流式细胞术的临床应用主要集中在血液病的白血病分型和细胞免疫检测, 其检测样本主要为全血样本、骨髓样本或为单个核细胞悬液的其他样本, 而对于其在脑脊液样本中分析应用以及在神经系统疾病中临床应用评价较少。因此, 本研究主要建立流式细胞术的脑脊液检测方法, 并初步探讨流式细胞术在神经系统疾病的临床应用。

本研究结果显示, 在各类(炎性与非炎性)神经系统疾病中流式细胞术检测到淋巴细胞群百分率可到达65.3%, 而脑脊液常规检测时其异常率仅为32.86%, 与类似研究结果相似[1]。因此, 流式细胞术检测脑脊液中免疫炎性状态较传统的脑脊液常规检测等分析具有更高的敏感性。同时流式细胞术的脑脊液分析可以同步完成多参数分析, 进一步分析T淋巴细胞亚群中CD3、CD4和CD8 T淋巴细胞的表达情况。

本研究图1显示反映细胞颗粒大小的FS指标容易受细胞大小变化影响。图1(d)中P2门内的细胞群实际上包括了图1(c)中P1门内的细胞及门外中性粒细胞的群体。因此, 流式细胞术检测脑脊液样本时建议使用SS vs.CD45-APC双参数散点图确定淋巴细胞群为最佳方案, 其根据细胞内颗粒及其复杂程度和淋巴细胞特异性高表达的CD45分子双参数可更准确的确定细胞类型。

淋巴细胞在机体免疫反应中具有重要作用, 而T淋巴细胞在细胞免疫活化和免疫效应的发挥中均发挥重要协同作用。采用流式细胞术探讨T淋巴细胞亚群在各类炎性和非炎性神经系统疾病中的应用具有重要的临床意义。探讨神经系统免疫相关疾病外周血中细胞和体液免疫机制[2, 3, 4]或脑脊液中免疫紊乱机制[5, 6]已成为神经系统疾病中新的关注方向。本研究中主要探讨了脑脊液的细胞免疫在各类神经系统免疫相关疾病发生发展中的作用, 针对其不同免疫紊乱状况进行了比较分析。本研究结果提示, 神经系统变性疾病如周围神经病、运动神经元病等, 采用流式细胞术分析脑脊液中细胞免疫状况的价值不大。因为该类疾病中主要为神经系统变性所致, 而非免疫细胞异常。因此, 对于该类疾病并不建议采用流式细胞术分析其脑脊液中淋巴细胞表达。但是对于神经系统免疫异常疾病, 如中枢神经系统炎性疾病(包括细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎)、脱髓鞘疾病和脑肿瘤等采用流式细胞术分析患者脑脊液中细胞免疫状况有助于分析病情。本研究表2和图2结果显示, 各类免疫相关神经系统疾病患者脑脊液中CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞百分率虽无明显差异, 但其百分率均高于外周血, 与其他研究结果相同[7, 8, 9]。细菌性脑膜炎和脊髓炎患者, 尤其是化脓性脑膜炎患者脑脊液中高百分率的CD3+CD4+T淋巴细胞提示CD3+CD4+T淋巴细胞积极参与感染性患者的免疫调控, 有助于患者固有免疫向获得性免疫转换, 增加机体抵抗力; 与格林-巴利综合症比较, 多发性硬化患者脑脊液中高表达的CD4/CD8比值提示脑脊液中相对高表达的CD3+CD4+T淋巴细胞与多发性硬化的发生发展密切相关, 与Piccio等[8]研究结果相似。多发性硬化患者脑脊液中T淋巴细胞的高迁移与疾病的发生发展密切相关, 治疗后多发性硬化患者脑脊液中T淋巴细胞和B淋巴细胞表达率降低, 而脑脊液IgG合成率、IgG浓度及寡克隆带在多发性硬化患者治疗后未发生明显变化, 提示免疫细胞的迁移参与了疾病的发展。多发性硬化患者脑脊液中T淋巴细胞百分率的变化可较脑脊液中免疫球蛋白的变化更早的反映患者的疾病状态。本研究进一步提示多发性硬化患者脑脊液中T淋巴细胞亚群表现为CD3+CD4+T淋巴细胞相对增加为主的失衡, CD3+CD4+T淋巴细胞百分率与IgG生成指数间的相关性提示, CD3+CD4+T淋巴细胞的聚集及其免疫辅助效应的增强促进B淋巴细胞活化及脑脊液中免疫球蛋白合成增加, 在伴有IgG合成率异常的多发性硬化中发挥重要免疫调控作用。

有研究显示, 正常淋巴细胞和内皮细胞表面黏附分子表达差异可能决定了细胞迁移结果, CD3+CD4+T淋巴细胞表面高表达CD154主要参与了外周血中CD3+CD4+T淋巴细胞向脑脊液中迁移[10]。但是在中枢神经系统炎性等疾病状态下, 可能由于细胞表面分子表达差异及其血脑屏障的损伤和淋巴细胞的非选择机制导致了中枢神经系统炎性患者不同亚群淋巴细胞对血脑屏障的穿透性改变[11, 12]。本研究显示在化脓性脑膜炎和多发性硬化患者中脑脊液的细胞免疫以CD3+CD4+T淋巴细胞相对增加为特征, 与其他研究[13]结果相同。各类神经系统疾病患者脑脊液中CD4/CD8比值增高提示在免疫相关的神经系统疾病中, 淋巴细胞通过各类黏附分子穿过血脑屏障, 进入脑脊液参与疾病的发生发展, 而且具有重要免疫调控作用的CD3+CD4+T淋巴细胞更倾向于迁移至脑脊液中参与免疫调控。表2结果提示外周CD3+CD4+T淋巴细胞在细菌性脑膜炎和脊髓炎中具有更强的脑脊液迁移性。因此高表达的CD3+CD4+T淋巴细胞在神经系统的免疫炎性疾病中发挥重要作用; 而疾病状态下外周CD3+CD4+T淋巴细胞与CD3+CD8+T淋巴细胞迁移机制的差异可能是导致患者脑脊液中以CD3+CD4+T淋巴细胞为主的致病机制。

总之, 流式细胞术检测对于神经系统炎性疾病病情的了解和监测具有一定的临床意义, 但对于神经系统变性疾病的应用有限。在炎性神经系统疾病中流式细胞术分析较脑脊液常规和IgG合成率等指标更有优势, 敏感性更高。同时可以分析患者脑脊液中免疫状况, 有助于判断病情和进行疾病监测。对于分析感染类型(细菌或病毒)也具有临床意义— — 流式细胞图中可直观了解多形核细胞、单核细胞及淋巴细胞表达情况。不同感染类型的炎性疾病和不同类型脱髓鞘疾病中T淋巴亚群CD4/CD8比值具有不同表现。目前认为该比值异常与疾病类型有一定相关性, 但本研究中各类神经系统疾病患者例数较少以致检验效能不足。因此, 后期仍需增加样本量明确结论。

The authors have declared that no competing interests exist.

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