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陆怡德, 杨帆, 董丹凤, 杨迟晖, 彭奕冰. 氨基糖苷类药物对尿液总蛋白检测的干扰分析. 2012, 27(5): 336-340
LU Yide, YANG Fan, DONG Danfeng, YANG Chihui, PENG Yibing.. The analysis of aminoglycoside interference in urine total protein determination. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 336-340  
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氨基糖苷类药物对尿液总蛋白检测的干扰分析
陆怡德, 杨帆, 董丹凤, 杨迟晖, 彭奕冰
上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海 200025

作者简介：陆怡德,男,1972年生,学士,主管技师,主要从事临床生化检验工作。

通讯作者：彭奕冰,联系电话：021-64370045-600621。

摘要

目的 探讨美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP7-A2 文件对于筛查、量化临床化学尿液样本分析干扰的实际应用,评价氨基糖苷类抗菌药物对尿总蛋白检测的干扰效应。方法 遵循CLSI EP7-A2文件,选取尿总蛋白浓度为77、146、538、832 mg/L的新鲜尿液样本,分别加入最大治疗剂量时每升尿液中3倍浓度的硫酸依替米星溶液,采用邻苯三酚红钼法分别进行干扰筛选试验。4种浓度尿液样本中分别加入由硫酸依替米星和一级纯水配制而成的梯度浓度溶液(0、0.15、0.30、0.45、0.60 mg/mL),进行干扰效应试验。通过多项式回归分析量化干扰效应,估计在任何干扰物浓度水平下的干扰度。结果 在尿总蛋白浓度分别为77、146、538、832 mg/L的尿液样本中加入0.6 mg/mL硫酸依替米星溶液,其干扰效应点估计值置信区间下限均超过医学决定水平处的允许误差。在尿总蛋白浓度分别为77、146、538、832 mg/L的尿液样本中加入5个干扰浓度(0、0.15、0.30、0.45、0.60 mg/mL)的硫酸依替米星溶液,得出的系列浓度均为线性剂量效应关系,其线性方程分别为 Y=202 X-1 .2、 Y=187 .3 X+4、 Y=325 .3 X+0 .6、 Y=345 .3 X+6 .4。通过回归方程分析得出尿总蛋白浓度为77、146、538、832 mg/L时,加入0.08、0.15、0.35、0.50 mg/mL硫酸依替米星溶液所引起的正干扰效应均超过临床可接受的允许误差。结论 硫酸依替米星对邻苯三酚红钼法测定尿总蛋白存在正干扰;临床实验室需进行分析干扰实验,筛选潜在干扰物质、量化干扰效应、评估潜在风险,并建立对临床有意义的干扰声明。

关键词: 总蛋白; 尿液; 氨基糖苷类抗菌药物; 干扰分析
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0336-05
The analysis of aminoglycoside interference in urine total protein determination
LU Yide, YANG Fan, DONG Danfeng, YANG Chihui, PENG Yibing.
Department of Clinical Laboratory,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract

Objective To investigate the practical application of the interference screening and quantification for urine analysis in clinical chemistry according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2 document, and evaluate the interference effects of aminoglycoside antibiotic in urine total protein determination.Methods According to the CLSI EP7-A2 document, fresh urine specimens with the urine total protein concentrations of 77, 146, 538 and 832 mg/L were collected, and the etimicin sulfate solution of 3 times maximum therapeutic dosage per liter of urine was added. The interference was screened by pyrogallol red-molybdate assay. The interference effects were quantified, and the etimicin sulfate solution and distilled water were added to form a concentration gradient (0, 0.15, 0.30, 0.45 and 0.60 mg/mL) of the interferent for each group. By multiple regression analysis, the degrees of interference at any interferent concentrations were estimated.Results After adding 0.6 mg/mL of etimicin sulfate solution into 4 groups (with the urine total protein concentrations of 77, 146, 538and 832 mg/L), the lower confidence limit of interference effect exceeded the allowable error at the medical decision concentration. Adding 5 concentrations of the etimicin sulfate solution into each specimen group, the five-level dose-response series (0, 0.15, 0.30, 0.45 and 0.60 mg/mL) all showed a linear relationship, and the linear equations were Y=202 X-1 .2, Y=187 .3 X+4, Y=325 .3 X+0.6 and Y=345 .3 X+6 .4 . It indicated that the positive interference effects caused by etimicin sulfate while adding 0.08, 0.15, 0.35 and 0.50 mg/mL of the interferent into each urine group, all exceeded the allowable error.Conclusions The etimicin sulfate causes a positive interference in the pyrogallol red-molybdate assay for urine total protein determination. Clinical laboratories need to perform the interference tests to screen potential interferents, quantify interference effects, evaluate potential hazards and establish meaningful interference claims.

Keyword: Total protein; Urine; Aminoglycoside antibiotic; Interference analysis

尿总蛋白的检测是某些临床疾病(例如肾功能衰竭、先兆子痫、多发性骨髓瘤等)病程监测的重要手段[1, 2]。对于服用氨基糖苷类药物的患者, 由于氨基糖苷类药物本身具有肾毒性, 患者需定期监测药物对其肾脏的影响, 因此尿总蛋白检测结果的准确性显得尤为重要。在临床工作中, 我们发现个别静脉滴注过氨基糖苷类抗菌药物的患者在随后尿液检查中突然出现与临床症状不符的尿总蛋白升高现象。为了更好地了解氨基糖苷类抗菌药物是否对尿总蛋白检测存在干扰, 我们依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)颁布的EP7-A2文件, 对此干扰现象进行了分析。

材料和方法
一、材料

1.对象 收集上海交通大学医学院附属瑞金医院门诊患者24 h尿液样本, 且患者在最近未服用氨基糖苷类抗菌药物。

2.仪器与试剂 尿总蛋白检测试剂(批号13991)及配套校准品(批号12353)由德赛诊断系统上海有限公司生产; 检测仪器为Beckman-Coulter DXC800自动生化分析仪; 氨基糖苷类抗菌药物为硫酸依替米星注射液(规格:100 mL、10万单位依替米星, 批号1007152), 由江苏制药有限责任公司生产。

二、方法

根据CLSI EP7-A2文件[3], 选取尿总蛋白的医学决定水平及对临床应用有参考价值的分析物浓度。采用最大治疗剂量时每升尿液中3倍的干扰物浓度, 确定具有临床意义的判断标准。

1.样本制备 收集尿总蛋白浓度为77、146、538、832 mg/L的新鲜尿液样本, 并在5 mL新鲜尿液中分别加入硫酸依替米星溶液及等量一级纯水, 制备成测试样本及对照样本。

2、干扰筛选试验 样本测定的重复次数由干扰偏差临界值与批内标准偏差的比值(dmax /s)和置信度共同决定。按照以下公式计算:n=2[(z1-α /2+ z1-β )s/dmax]2, 式中z1-α /2为正态分布时双侧检验100(1-α )%的百分位值、z1-β 为正态分布时100( 1-β )的百分位值、s为批内标准差、dmax为分析物在某测试浓度水平时的最大允许干扰值。尿液离心后采用邻苯三酚红钼法(pyrogallol red-molybdate complex method, PRM)检测尿总蛋白。保留检测结果, 比较偏差与干扰效应点估计值置信区间下限是否超过医学决定水平处的允许误差, 从而了解氨基糖苷类抗菌药物是否会对尿总蛋白产生干扰。

3、干扰效应试验 在2份新鲜尿液中分别加入高浓度硫酸依替米星溶液和等量一级纯水, 等体积混合形成中间浓度溶液, 最后再两两混合分别配制成中低浓度和中高浓度溶液, 配制成的硫酸依替米星溶液最终浓度分别为0、0.15、0.30、0.45、0.60 mg/mL。在同一分析批次内测定5个尿液样本, 且每个样本重复检测3次。

三、统计学分析

运用SPSS13.0软件进行统计分析, 计算重复测定检测结果间的偏差, 通过多项式回归分析了解干扰物浓度与干扰度之间的关系。

结 果
一、干扰筛选试验

以尿总蛋白浓度为146 mg/L的试验为例。配制浓度为0.6 mg/mL的硫酸依替米星溶液, dmax=146 (mg/L)× 21.8%=31.8, s=6.7, 95%可信区间时dmax /s> 3.0, n=3, 即重复检测3次。检测结果见表1。95%可信区间下限(Lower confidence limit)> 最大允许干扰值(dmax), 因此可认为硫酸依替米星对于以上各浓度尿总蛋白的检测存在干扰。

表1 干扰筛选试验检测结果表
二、干扰效应

在尿总蛋白浓度为77、146、538、832 mg/L时, 5个干扰浓度的硫酸依替米星对尿总蛋白的影响均呈线性关系, 见表2, 其线性方程分别为Y=202X-1.2、Y=187.3X+4、Y=325.3X+0.6、Y=345.3X+6.4。通过回归方程分析得出在尿蛋白浓度为77、146、538、832 mg/L时, 加入0.08、0.15、0.35、0.50 mg/mL硫酸依替米星溶液所引起的正干扰效应均超过临床可接受的允许误差。

表2 5个系列干扰浓度线性效应实验结果
讨 论

分析干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时, 受另一种非分析物影响而导致测定结果的增高(正干扰)或降低(负干扰)[4]。在临床工作中, 某些药物未预料的干扰作用会对临床检验结果造成重大的影响, 混淆医生对患者病情的判断。因此, 每个实验室必须了解分析方法的特异性, 遵循CLSI EP7-A2文件, 鉴别干扰物质, 量化干扰效应并建立有意义的干扰声明。

在进行干扰试验前, 必须确保仪器不存在携带污染, 并已按照厂商说明进行定期的维护和校准, 各项性能指标皆符合临床的使用要求。此外, 要确定干扰试验的判断标准, 即临床可接受的允许误差。本研究参考了西班牙临床化学及分子生物病理协会(Spanish Society of Clinical Chemistry and Molecular Pathology Commission)基于生物学变异导出的分析质量目标, 并选用最适宜的质量规范— — 二分之一的允许误差(21.8%)作为评价标准。在整个实验操作过程中, 需严格执行实验室制定的质量控制程序和检验操作规程, 并以质控品进行常规质量控制, 监测整个分析操作过程。

本研究按照干扰筛选试验、干扰效应试验及建立干扰声明的顺序进行。干扰筛选试验亦称为“ 配对差异” (paired-difference), 其目的在于鉴别潜在的干扰物质, 评价分析方法对干扰的敏感性。根据EP7-A2文件, 本研究选择了尿总蛋白医学决定水平及对临床应用有参考价值的分析物浓度(77、146、538、832 mg/L), 采用最大治疗剂量时每升尿液中3倍的干扰物浓度(0.6 mg/mL硫酸依替米星溶液)进行干扰筛选。为保证在研究过程中筛选出具有临床意义的干扰, 结合最大允许干扰值、批内精密度、统计学检验水准, 本研究确定每个样本重复检测3次。结果显示, 干扰效应点估计值可信区间下限超过医学决定水平处的允许误差, 证明硫酸依替米星溶液对尿总蛋白检测存在干扰, 需进行干扰效应试验。干扰效应试验亦称为“ 剂量效应” (dose-response), 可确定干扰物浓度和干扰度之间的关系, 并对测量范围内的任何干扰物浓度进行效应估计。本研究选用由硫酸依替米星和一级纯水配制而成的梯度浓度溶液(0、0.15、0.30、0.45、0.60 mg/mL ), 分别加入4种尿总蛋白浓度(77、146、538、832 mg/L)样本中。为避免批间差异, 所有样本在一个分析批内随机排序检测。对干扰物浓度和干扰效应结果进行多项式回归分析, 所得出的剂量效应均为线性关系, 4种尿总蛋白浓度的线性方程分别为Y=202X-1.2、Y=187.3X+4、Y=325.3X+0.6、Y=345.3X+6.4。通过以上回归方程可得出:在尿蛋白浓度为77、146、538、832 mg/L时, 加入0.08、0.15、0.35、0.50 mg/mL硫酸依替米星溶液检测所产生的偏倚超过了临床可接受的允许误差, 硫酸依替米星溶液对PRM检测尿蛋白存在正干扰。

根据国外文献报道, 不同厂商生产的PRM试剂, 由于其染料组分、阴离子洗涤剂(sodium dodecyl sulfate, SDS)浓度及反应体系各不相同, 对于氨基糖苷类药物干扰的效应也大不相同[6]。在弱酸性环境下, 带正电荷的蛋白质与带负电荷的邻苯三酚红-钼酸复合物形成离子缔合物, 使染料的吸收峰发生红移。但同样的弱酸环境下, 以原形存在于尿液中带阳离子的硫酸依替米星, 在SDS的存在下, 通过静电引力作用也与染料形成红色离子缔合物, 造成吸光度值的增高, 从而导致尿总蛋白检测结果的假阳性升高。

因此, 试剂生产的厂商有义务明确表明试剂成分及含量, 并在临床需要的基础上评价干扰物, 告知临床已知有医学意义的误差来源。对临床实验室而言, 则应进行科学有效的实验设计, 在查阅相关资料的基础上, 筛选潜在干扰物质, 量化干扰效应, 以真实的数据来确认分析方法对干扰物的敏感性, 评估潜在风险, 并寻找设计改进的方案, 为临床提供更优质、更准确、更可靠的数据服务。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] McElderry LA, Tarbit IF, Cassells-Smith AJ. Six methods for urinary protein compared[J]. Clin Chem, 1982, 28(2): 356-360. [本文引用:1]
[2] Waller KV, Ward KM, Mahan JD, et al. Current concepts in proteinuria[J]. Clin Chem, 1989, 35(5): 755-765. [本文引用:1]
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[4] 杨有业. 临床检验方法学评价[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2008: 196-200. [本文引用:1]
[5] Marshall T, Williams KM. Total protein determination in urine: elimination of a differential response between the coomassie blue and pyrogallol red protein dye-binding assays[J]. Clin Chem, 2000, 46(3): 392-398. [本文引用:1]
[6] Marshall T, Williams KM. Elimination of the interference from aminoglycoside antibiotics in the pyrogallol red-molybdate protein dye-binding assay[J]. Clin Chem, 2004, 50(9): 1674-1675. [本文引用:1]