引用本文
费国强, 李晓鸽, 钟春玖. 全血硫胺素及其衍生物的高效液相色谱检测方法的建立. 2012, 27(5): 331-335
FEI Guoqiang, LI Xiaoge, ZHONG Chunjiu. HPLC determination of thiamine and its derivatives in human whole blood. Labratory Medicine, 2012, 27(5): 331-335  
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全血硫胺素及其衍生物的高效液相色谱检测方法的建立
费国强1, 李晓鸽2, 钟春玖1
1.复旦大学附属中山医院,上海 200032
2.中科院上海有机化学研究所,上海 200032

作者简介：费国强,男,1974年生,硕士,主要研究方向为硫胺素缺乏与神经变性疾病。

基金:上海市科委基础重大攻关基金资助项目（07DJ14005）
摘要

目的 建立一种稳定、快捷的全血硫胺素及其磷酸酯衍生物高效液相色谱(HPLC)荧光检测方法。方法 全血样本经三氯乙酸(TCA)去蛋白处理、铁氰化钾衍生,产生能被HPLC反向柱子经梯度洗脱分离的稳定荧光产物,通过荧光检测并与硫胺素及其磷酸酯衍生物标准样本比对,来确定人体全血硫胺素含量。方法通过线性方程、提取率、重复性等指标验证。结果 经过检测,焦磷酸硫胺素(TDP)、单磷酸硫胺素(TMP)和硫胺素的检测限分别为8.0、1.5和2.5 nmol/L,信噪比(S/N)>10,能够满足临床需要。线性趋势良好, r>0.99。硫胺素、TMP及TDP的回收率分别为103.7%、96.8%、101.7%,重复性好,变异系数( CV)<10%。结论 经TCA去蛋白、铁氰化钾衍生、梯度洗脱建立的荧光HPLC检测硫胺素及其磷酸酯衍生物衍生物的方法可靠,可用于临床检测。

关键词: 硫胺素; 铁氰化钾; 高效液相色谱
中图分类号:Q563 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)05-0331-05
HPLC determination of thiamine and its derivatives in human whole blood
FEI Guoqiang1, LI Xiaoge2, ZHONG Chunjiu1
1.Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
2. Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Science, Shanghai 200032, China
Abstract

Objective To establish a stable and rapid method for determining the levels of human whole blood thiamine and its phosphate ester derivatives by high performance liquid chromatography (HPLC).Methods After blood proteins were precipitated by trichloroacetic acid (TCA), thiamine and its phosphate esters were derivatized using potassium ferricyanide into thiochromes. The derivatives of thiamine and it phosphate esters were separated by a reversed-phase HPLC column and measured by fluoroscope. The method was validated by the analysis of linearity, extraction ratio and repeatability.Results The lower limits of quantification of blood thiamine diphosphate (TDP), thiamin monophosphate (TMP) and thiamine determinations were 8.0, 1.5 and 2.5nmol/L respectively. The signal to noise ratio (S/N) for determining thiamine and its derivatives was>10. The linear relationship was stable ( r>0.99). The recovery rates of TDP, TMP and thiamine were 103.7%, 96.8% and 101.7% respectively. The repeatabilities were good. All the coefficients of variation ( CV) were <10%.Conclusions The HPLC with thiamine derivatization by potassium ferricyanide for determining thiamine and its phosphate ester derivatives is reliable and can be used for clinical analysis.

Keyword: Thiamine; Potassium ferricyanide; High performance liquid chromatography

硫胺素即Vit B1, 在体内有以下多种形式存在, 游离硫胺素(free thiamine, FT)、单磷酸硫胺素(thiamine monophosphate, TMP)、焦磷酸硫胺素(thiamine diphosphate, TDP)、三磷酸硫胺素(thiamine triphosphate, TTP)。其中最重要的是TDP, 约占了硫胺素总量的90%以上。TDP在作为体内能量代谢(碳水化合物、脂肪和酒精)关键酶α -酮戊二酸脱氢酶(KGDH)、丙酮酸脱氢酶(PDH)和转酮醇酶(TK)的辅酶, 直接参与了机体能量代谢和氧化应激反应[1]。而TTP可能参与体内中枢神经系统离子通道的信号传导[2]。因此, 硫胺素缺乏可直接导致体积能量代谢障碍和神经系统损害, 如认知功能下降、韦尼克脑病等。由此可见, 能够准确检测人体硫胺素及其磷酸酯衍生物含量, 判断人体是否存在硫胺素缺乏, 不单对临床工作, 而且对于研究硫胺素在人体内的功能及生理作用都具有重要意义。由于TTP在体内的含量很低, 在外周血中基本检测不到。所以, 人体TDP、TMP和FT的含量之和接近于人体总硫胺素含量。由于TDP在红细胞中的代谢与其他器官相似, 检测血液的TDP含量可用来估算人体总的硫胺素含量[3]。但以往的硫胺素检测方法[4]不能将硫胺素各磷酸酯单独定量, 主要是通过将硫胺素磷酸酯去磷酸化以后, 采用荧光检测总FT含量。虽然这种方法目前也在用, 但由于去磷酸化过程需要时间过长, 往往要超过24 h, 且不能直接测定TDP含量, 故目前应用在逐渐减少。近年来, 随着免疫荧光技术发展, 发现硫胺素及其磷酸酯衍生物经铁氰化钾衍生, 可以得到稳定的荧光产物[5], 为人体全血硫胺素及其磷酸酯衍生物的检测创造了条件。目前国内医疗机构均未在开展人体硫胺素的临床检测工作, 也未见相关检测方法的报道。

材料和方法
一、主要仪器设备及试剂

1.主要试剂 硫胺素、TMP、TDP标准品(美国Sigma公司), 铁氰化钾、Na2HPO4· 12H2O(国药集团化学试剂有限公司), 三氯乙酸(TCA)(如皋市化学试剂厂), 甲基叔丁醚(美国Tedia公司), 甲醇(德国Merck公司)。

2.主要仪器设备 Agilent 1100 液相色谱系统(配有1200荧光检测器, 安捷伦科技有限公司), SC 2超微量电子天平(Sartorious公司), FA 1004电子分析天平、pH计(上海上平仪器有限公司), 微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂), 离心机(上海安亭科学仪器厂)。

二、检测方法的建立

1.色谱条件 色谱柱:Agilent Extend C18柱(4.6 mm× 150 mm, 5 μ m); pH值范围:111; 检测温度:室温; 荧光激发波长:375 nm; 发射波长:435 nm; 流动相:A为CH3OH, B为25 nmol/L Na2HPO4(pH值7.0)

2.梯度洗脱 见表1。

表1 梯度洗脱

3.进样量 10 μ L。

4.样本预处理 (1)血样采集:采集志愿者外周静脉血3 mL, 肝素抗凝, -80 ℃冻存, 备用; (2)预处理:血样室温解冻后取300 μ L, 加300 μ L TCA, 旋转震荡3 min, 充分混合, 10 000× g离心15 min, 取上清。用0.2 μ m膜过滤后, 加入甲基叔丁醚0.5 mL洗涤(共3次), 取下清液备用。取去蛋白处理后的上述样本80 μ L+甲醇20 μ L+铁氰化钾50 μ L衍生后即刻进样。标准品的预处理过程同血样。

5.主要检测指标 检出下限、线性方程、提取率、荧光物质的稳定性、重复性。

结 果
一、保留时间与检测限的确立

标准品经过TCA去蛋白处理, 甲基叔丁醚洗涤后, 经铁氰化钾衍生后进样10 μ L, 色谱图见图1; 健康志愿者血样经相同方法处理后进样, 色谱图见图2。两者TDP、TMP和硫胺素保留时间基本一致, 分别为4.2、5.2和7.9 min左右, 单个样本的测试所需时间在15 min左右。当信噪比(S/N)> 3可以用作定性检测。S/N> 10可以定量检测。通过不同浓度标样探索, TDP、TMP和硫胺素的定量检出下限约为8.0、1.5、2.5 nmol/L, 基本能够满足检测需要。

图1 TDP、TMP和硫胺素的标准溶液色谱图

图2 健康人群的血液色谱图

二、线性

配置不同浓度标准品溶液, 经前期处理后, 分别进样10 μ L检测, 用以确定TDP、TMP和硫胺素线性关系及方程式。见表2、图3图5。

表2 线性检测不同标准品浓度

图3 硫胺素线性关系及线性方程式(注:A=2.364C, r=0.998, r2=0.996)

图4 TMP线性关系及线性方程式(注:A=2.291C, r=0.998, r2=0.997)

三、提取率

配制标准品S0(TDP、TMP和硫胺素的浓度分别为1 000、100、100 μ mol/L)。取360 μ L血样3份, 分别添加40 μ L S0、20 μ L S0+20 μ L H2O、40 μ L H2O, 充分混匀后去取300 μ L, 相当于在血样中增加TDP、TMP、硫胺素的浓度分别为100、10、10和50、5、5 nmol/L。如前述标准品预处理办法处理后进样10 μ L, 见图6, 保留时间一致。利用上述线性公式, 计算硫胺素、TMP、TDP的提取回收率分别为103.7%、96.8%、101.7%和102.7%、103.4%、98.6%。提取回收率符合检测要求。

图5 TDP线性图及线性方程式(注: A=1.740C, r=0.998, r2=0.996)

四、荧光物质的稳定性

正常血样加标准品, 反应后立即进样与室温不避光放置约40 min后进样, 结果重复, 证明产物稳定。见图7。

图6 TDP、TMP和硫胺素的提取回收率

图7 荧光物质的稳定性

五、重复性

同一血样取5份, 按相同方法进行前期处理, 衍生后进样, 保留时间和峰面积基本一致。RSD值均< 10%, 说明血样处理方法稳定, 对检测结果影响小, 重复性好。见表3。

同一志愿者血样, 间隔1周, 相同方法处理后进样。结果显示, 在同样检测条件下, 保留时间与峰高基本一致, 按线性方程计算浓度, CV< 10%, 说明放置稳定性好, 血样冻存满足检测需要。见图8。

表3 血样前期处理对检测结果的影响

图8 放置稳定性

讨 论

如前所述硫胺素在体内有多种形态存在, 其中90%以上是TDP, 主要存在于红细胞内, 主要参与能量代谢[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12] , 而FT和TMP主要存在于血浆中。由于TTP主要存在中枢神经系统, 且含量甚微, 无法在外周血中被检测出。因此, 检测TDP、TMP及游离硫胺素含量基本能够反映人体硫胺素的总体水平。上述应用TCA去蛋白处理、铁氰化钾衍生后, 通过梯度洗脱进行硫胺素及其磷酸酯衍生物检测的方法, 由于检出限足够低, 线性良好, 提取率和重复性良好, 可以基本满足临床检测需要。此方法不单可用于阿尔茨海默病(AD)患者硫胺素检测, 对硫胺素缺乏相关疾病(如韦尼克脑病、酒精中毒、脚气病)的诊断也有很实用的临床价值。以往硫胺素的检测[4]需要将硫胺素磷酸酯去磷酸化后, 通过检测FT来判断人体总的硫胺素含量, 去硫胺素过程需超过24 h, 结果也不能反映在体内起主要生理作用的TDP的直接含量。而本研究所述方法检测单个样本的梯度洗脱时间< 15 min, 即快捷又实用。如果要进一步缩短检测时间, 一方面可以通过改变流动相来实现, 另一方可以通过应用短柱(50 mm)来分离使保留时间提前。在收集血样和检测过程还应注意:(1)低温冻存:血样采集后应及时低温(-70-80 ℃)冻存, TDP主要存在于红细胞内, 低温冻存一方面促使红细胞胞膜破碎更加完全, 有利于TDP释放。另一方面, 血样采集以后, 及时低温冻存, 可以保证红细胞内KGDH和PDH酶活性及时灭活, 减少了TDP的消耗。此外, 也可以致使硫胺素磷酸激酶快速灭活, 减少了FT、TMP向TDP的转化, 使得检测结果更加接近于采样时人体外周血实际硫胺素含量。(2)抗凝剂:Ihara等[13]报道, 血样抗凝剂选择无论是肝素还是EDTA, 对于检测并无影响。(3)去蛋白剂:在课题之初, 我们曾选择乙腈作为去蛋白剂, 离心后保留液体呈淡黄色, 样本虽经0.2 μ L膜过滤处理, 在进行荧光检测时, 硫胺素等保留时间尚比较稳定, 但杂峰较多, 基线不易稳定。经改用TCA后, 去蛋白更加彻底, 避免了上述问题。(4)进样量:即使使用pH值范围较大的HPLC柱子, 其适应的pH值范围在111之间, 铁氰化钾与硫胺素及其磷酸酯衍生物进行衍生反应时, 需要在强碱(氢氧化钠溶液)条件下, 即使在使用预柱的情况下, 强碱对柱子的损伤仍比较大。因此, 在保证检测下限的前提下, 尽可能减少进样量, 以延长柱子的寿命。

因此, 采用经TCA去蛋白处理、铁氰化钾衍生、梯度洗脱的HPLC检测全血硫胺素及其磷酸化衍生物方法, 方便、快捷、可靠、可重复性强, 可适用于临床检测及科学研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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