肝癌发生、发展中出现岩藻糖基化差异的靶蛋白有哪些?靶蛋白的糖基化改变在肝癌进展中具有怎样的变化趋势和作用?对这些问题迄今还没有完整的分析和解释。对肝癌相关岩藻糖基化差异蛋白的研究样本来源一般为肝癌患者的血清、组织和培养细胞等, 通过各种方法学对蛋白及蛋白的糖基化水平和结构进行鉴定和验证。

1. 血清蛋白 Comunale等^[2]鉴定出肝癌组和正常组血清岩藻糖基化水平表达差异蛋白20个左右, 按功能可分为转运、结合、代谢、凝血、纤溶、免疫类蛋白, 多数蛋白兼有与配体分子结合、蛋白酶抑制、免疫调节和出凝血调节等多项功能, 与肝脏功能密切相关。

2. 组织蛋白 Dai等^[4]鉴定了正常肝脏组织的核心岩藻糖基化蛋白约53个, 其功能涉及细胞信号转导、能量代谢、细胞周期调节、基因表达调控、细胞结构维持、细胞间相互作用等, 对肝癌细胞的生长非常重要。

肝癌的发生、发展分子机制异常复杂, 从癌前病变发展为原发性肝细胞癌经历了复杂的过程, 包括病毒感染、基因突变和表达异常、 表观遗传学异常、信号转导通路异常、蛋白表达和蛋白修饰异常等各微观分子机制; 但肝癌的发生、发展有一定的规律性, 经历肝炎-肝硬化-肝癌病理动态; 内分泌与代谢异常、胚胎期生理特性再现等各种病理生理改变, 临床特征与胰岛素抵抗、缺氧代谢、内分泌紊乱、免疫功能紊乱和低下等密切相关。岩藻糖基化蛋白在肝癌进展中发生的作用, 与肝癌细胞的生物学状态, 肝癌的病理、生理病理状态的相关性及其机制是值得研究的课题。现将其可能参与影响肝癌进展的机制分析如下。

(一)影响肿瘤细胞的生物学行为

大多数血清岩藻糖基化差异蛋白能够反应或影响肿瘤的生物学行为如生长、转化、增殖扩散、凋亡、迁徙和转移等特性。如研究发现岩藻糖基化蛋白胎球蛋白A(fetuin A)^[5]对肿瘤生长和转移具有促进作用, fetuin A通过钙离子介导与肿瘤细胞表面受体结合, 促进肿瘤克隆生长和减少凋亡。fetuin A基因沉默小鼠、野生小鼠和注射fetuin A的沉默小鼠之间肿瘤克隆生长出现差异, 并与fetuin A注射剂量有相关性。fetuin A很可能作为癌细胞重要的生长信号分子, 参与癌细胞在血管内的转移和生长。除外, 其他岩藻糖基化修饰的蛋白如载脂蛋白D(apo D)可参与抑制骨桥蛋白介导的细胞恶性转化, α 2巨球蛋白(AMG)可通过抑制β -连环蛋白信号转导而抑制肿瘤生长; α 1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)存在于各种癌细胞核中, 具有与DNA结合的性能, 能被癌细胞特异性摄取保存于核内, 显著地抑制对DNA复制起重要作用的DNA多聚酶, 从而抑制癌细胞的增殖。α 1抗胰蛋白酶(AAT)被认为可能通过抑制肿瘤细胞分泌的水解酶活性而抑制肿瘤的增殖扩散^[6]。AAT在肝癌患者血清中浓度明显升高, 且与肿瘤大小、有无肿瘤包膜及血管癌栓相关。目前观点认为肿瘤细胞溶酶体活力增高, 使得肿瘤组织释放大量蛋白水解酶。AAT增加是机体为了抑制蛋白分解, 从而控制肿瘤细胞增殖扩散的一种应激性反应。此外某些岩藻糖基化蛋白的抗血管生成的行为也对肿瘤的生长和侵袭具有影响, 如富组氨酸蛋白具有抗血管生成活性, 具有促血管内皮细胞凋亡、抑制血管生成的作用, 从而抑制肿瘤的生长^[7]。

(二)抗氧化应激, 调节肝脏炎症反应

肝癌是肝脏不断受损的结果, 氧化应激和炎症损伤对肝癌进展有重要影响, 某些蛋白可能通过减小肝脏损伤而在肝癌进展中发生作用。如岩藻糖基化修饰蛋白apo D主要存在于高密度脂蛋白中, 具有抗氧化作用, 调节机体氧化应激反应^[8]。ACT则能抑制人类中性粒细胞的过氧化物产物, 调节炎症时渗出的中性粒细胞、巨噬细胞的炎症反应, 阻止蛋白酶所致的周围组织破坏^[9]。

(三)参与免疫调节, 调节机体肿瘤免疫功能

在肝癌患者血清中出现岩藻糖基化修饰改变的免疫相关蛋白有免疫球蛋白G(IgG)、 免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C1s、补体因子B、AMG和α 1酸性糖蛋白(AGP)等, 多数蛋白在肝癌进展中显示出了免疫抑制作用, 与肝癌患者的免疫状态相一致, 参与免疫调节的机制可能有以下3个方面。

1. 影响细胞因子水平 如fetuin A和AMG可以与转化生长因子-β (TGF-β )、肿瘤坏死因子-α (TNF-α )等因子结合作用于肝脏炎症的发生过程。fetuin A氨基酸序列和TGF-β Ⅱ 型受体(Tβ R-II)具有同源性, 体外可结合TGF-β 家族因子, 很可能是这些细胞因子的拮抗剂。在爆发性肝衰竭小鼠模型中, fetuin A可能通过抑制TNF-α 等炎症因子来抑制肝组织炎症并减轻肝细胞凋亡^[10]。AMG则可与多种细胞因子如TGF-β 、白细胞介素-1(IL-1)、TNF-α 等结合, 调节细胞因子的体内分布、半衰期和生物学活性, 并能在体内外抑制多种免疫反应^[11]。

2. 影响免疫细胞的杀伤活性 部分岩藻糖基化修饰蛋白可直接影响杀伤细胞的活性, 如将ACT与自然杀伤细胞孵育可使其杀伤活性及抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)消失^[12]。有研究发现AGP的糖型对其免疫调节能力有影响, 从癌症患者血清或腹水获得的AGP能抑制干扰素(IFN)介导的自然杀伤细胞活性增加, 而健康人分泌的AGP却没有此类抑制作用, 这可能与癌症患者的AGP糖型改变有关^[13]。

3. 影响体液免疫 肝癌疾病进展中, 免疫球蛋白水平和糖结构也发生改变, 如在肝纤维化和肝硬化患者血清中, 一种异嗜性抗体的去半乳糖基化结构增多^[14]。免疫球蛋白的糖基化对其蛋白功能具有影响, 如IgG分子Fc片段CH2结构域的N-聚糖结构具有高度的异质性, Fc上的聚糖修饰可影响IgG与细胞受体及Clq的结合, 末端岩藻糖缺失可以影响抗体依赖的ADCC活性, 末端半乳糖残基可影响抗体与Clq之间的结合, 由此影响补体依赖的细胞毒作用(CDC)活性^[15]。肝癌相关免疫球蛋白的糖基化改变有可能参与肝癌体液免疫功能的调节。

(四)影响或反映机体内分泌和代谢状态

肝癌患者可以出现内分泌紊乱、胰岛素代谢抵抗、糖代谢紊乱和钙磷代谢障碍等。肝癌相关岩藻糖基化差异蛋白具有可逆结合和运载血红素、甲状腺素、维生素、脂质、多价金属离子等多种血清内分子功能, 并参与其代谢过程。通过文献复习发现蛋白及其糖基化水平可能与内分泌水平、代谢水平相关, 并可能通过某些机制互相影响。如岩藻糖基化差异蛋白fetuin A是一种天然的胰岛素受体抑制剂和全身性的异位钙化抑制剂, 高fetuin A血清浓度与人胰岛素抵抗及肝脂肪积聚有关^[16]。某些依赖于糖基化改变的信号转导途径能影响糖尿病的胰岛素抵抗过程, 并且与糖尿病患者的消瘦有关^[17]。有研究认为蛋白的糖基化也受细胞因子和激素等的调控, 如停经前后的女性血清蛋白N-糖图谱具有较大的差异, 并提示雌激素水平对蛋白岩藻糖基化具有影响^[18]。AGP基因有白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)和雌激素的相关调控元件, 细胞因子可对肝癌细胞AGP糖型合成进行调控, 肝癌细胞系HUH-7细胞在IL-1和IL-6刺激下, 其释放AGP的含分支岩藻糖结构的唾液酸化的路易斯寡糖 (Slex)结构增加^[19]。

肝癌诊断主要依赖于临床特征、影像学超声检查和AFP肝癌标志物的筛查。随着Cut-off值的不同, AFP的敏感性为20%70%, 特异性为80%99%; 1620 μ g/L被认为是最佳的Cut-off值, 特异性为90%, 敏感性为60%。但血清AFP水平被认为与肿瘤大小有关, 80%的小肝癌(< 2 cm)不出现AFP升高现象, 且有部分慢性肝炎患者和肝硬化患者血清中AFP有所升高^[3]。据文献复习, 岩藻糖基化修饰蛋白和蛋白岩藻糖基化水平对肝癌诊断具有一定的作用, 其中岩藻糖基化水平对肝癌表现出了较好的诊断效率, 对肝癌早期诊断、鉴别诊断、预警、分型分期、疗效评价和预后评估等方面具有作用。

(一)蛋白水平和肝癌诊断

此类蛋白血清水平在肝癌发展进程中具有不同的变化规律, 蛋白浓度常与肿瘤患者的生存状态、免疫、代谢状态和肿瘤的生物学行为有关, 也可以作为肝癌的诊断指标。如AAT在肝癌患者血清中浓度明显升高, 且与肿瘤大小、有无肿瘤包膜及血管癌栓相关^[6]。Kalabay等^[20]发现肝癌组fetuin A血清浓度明显低于正常组和急性肝炎组, 是肝癌及硬化患者短期死亡的独立预测因素, 与Child-pugh 分级、终末期肝病模型(MELD)积分相比, 血清低fetuin A水平与长期病死率具有更高的相关性。肝癌患者血清AGP浓度明显升高, 血清AGP浓度可以有效区分肝癌和肝硬化, 受试者工作特征(ROC)曲线下面积达0.88^[21]。这类蛋白在肝癌疾病演变中表现为几组动态变化模式:(1)正常→ 肝炎→ 肝硬化持续下调, 肝癌上调, 如结合珠蛋白(haptoglobin); (2)正常→ 肝炎→ 肝硬化持续上调, 肝癌下调; (3)正常→ 肝炎上调, 肝硬化下调, 肝癌上调, 常为急性时相蛋白, 如转铁蛋白、ACT、AAT等; (4)肝炎→ 肝硬化(肝癌)上调, 如高尔基体蛋白73(GP73)。

(二)糖基化水平和肝癌诊断

蛋白岩藻糖化水平变化趋势往往和蛋白水平无关, 甚至呈相反趋势, 但癌症类型和蛋白样本的来源有关。肝癌患者血清岩藻糖基化差异蛋白中, 除触珠蛋白外, 与健康组相比均表现为岩藻糖基化水平的升高。

1. 血清总蛋白N-糖谱图 Vanderschaeghe等^[22]利用基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE)方法获得原发性肝细胞癌患者血清总蛋白的N-糖结构图谱, 发现血清蛋白的某些特征性糖基化结构, 可用于监测肝纤维化、肝硬化、肝癌的发生和发展, 建立基于图谱中各峰值改变的GlycoCirrhoTest、GlycoFibroTest和 GlycoHCCTest诊断模型, 并将此系列诊断应用命名为“ GlycoHepatoTest” 。本实验室在2010年也报道了血清N-糖标志物在诊断、鉴别诊断肝癌中的应用价值^[23]。本实验室通过DSA-FACE方法获得去唾液酸化的血清蛋白N-糖图谱至少912个峰, 其中logP9/P4(第9峰与第4峰比值)对肝癌和肝纤维化的鉴别诊断效率与AFP相似, 曲线下面积分别为0.873和0.888。

2. 单个蛋白岩藻糖基化修饰水平的诊断应用 (1)AFP-L3:AFP中与小扁豆凝集素亲和力最强的部分为AFP-L3, 即核心岩藻糖基化的AFP, 也称为AFP异质体。AFP-L3 与 AFP 值无相关性, 可以作为一个独立的肝细胞癌诊断因子。许多文献均报道AFP-L3%具有比AFP更高的敏感性和特异性。AFP-L3%用于原发性肝细胞癌诊断特异性> 95%, 与更差的肝癌肿瘤分期和肿瘤生物学行为相关。原发性肝细胞癌患者AFP-L3阳性(AFP-L3%> 10%)提示肿瘤生长速度快且可能发生早期转移, 与影像学相比较, AFP-L3对小肝癌(< 2 cm)的诊断可提前912个月, AFP-L3的诊断敏感性随肝癌的分期和肿瘤侵袭性而发生变化, 对于小肝癌(< 2 cm)其敏感性不超过45%, 但对于直径≥ 5 cm的肝癌, 其敏感性达到90%以上。AFP-L3%可作为肝癌患者复发转移后的监测及预后指标, 治疗后AFP-L3%阳性可能提示治疗不成功、复发或转移; 肝癌术后AFP-L3%变化比AFP水平更能说明病情^[3]。 目前AFP-L3的检测方法有亲和免疫交叉电泳法、凝集素亲和电泳免疫印迹法、亲和层析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、自动分析系统和微流控芯片法等, 其原理常为根据AFP与凝集素的亲和程度进行分离, 然后用免疫学方法进行定量检测, 或使用抗AFP-L3抗体直接进行免疫学检测^[24]。电泳法、印迹法等方法操作步骤繁多, 时间长, 敏感性较低, 限制了临床应用。我国市售及临床常用方法均为微量离心柱亲和吸附法。此方法是在AFP测定的基础上增加一个亲和吸附的前处理步骤, 计算AFP-L3占总量的百分比, 测定时间大大减少, 方法较为简便, 缺点是手工操作部分没有质控措施。日本Wako公司近年已经研制出新型自动检测系统(LiBASys)用于检测AFP-L3的含量, 其根据液相竞争原理(AFP单克隆抗体与凝集素竞争结合AFP异质体) 结合柱层析技术, 可同时测定AFP异质体比率和AFP总量, 并已受FDA的认可。本实验室曾比对微量离心柱亲和吸附法和凝集素亲和免疫电泳自显影法, 发现两者具有较好的一致性^[25]。ELISA是使用基于抗人AFP-L3特异性抗体建立的酶联免疫吸附方法, 可定量AFP-L3浓度, 方法简便, 成本也较低, 但目前尚无商业化试剂盒供临床使用; (2) 岩藻糖基化修饰的其他蛋白:有研究发现, 肝癌患者fetuin A和血红素结合蛋白岩藻糖基化水平高于肝硬化组和正常组^[26], 其中岩藻糖基化胎球蛋白对肝癌和非肝癌的鉴别诊断的ROC曲线下面积达到0.86, 而岩藻糖基化血红素结合蛋白对2组鉴别诊断的ROC曲线下面积达到0.95。在一个300例样本的肝癌诊断模型中, 通过DSA-FACE方法获得肝癌患者血清血红素结合蛋白的N-糖图谱, 发现其糖标志物ROC曲线下面积达到0.95, 敏感性和特异性分别为92%和92%^[27], 诊断效率高于AFP(0.82)。在肝癌进展中AAT也出现核心岩藻糖基化和多分支岩藻糖基化水平的升高, AAT的岩藻糖基化水平对肝癌诊断的敏感性为70%, 特异性为80% ^[28]。Hashimoto等^[29]对术前及术后肿瘤患者AGP水平和糖型随访研究发现, 岩藻糖基化AGP不仅更能够区分肿瘤组、正常组及肿瘤分期, 还可以提示疾病进展和预后。进展期肿瘤患者AGP三四天线的岩藻糖基化糖型增多, 而出现多天线岩藻糖基化蛋白的患者也有较差预后。在一项包括80个样本的病例对照研究中发现, GP73对肝癌诊断的敏感性和特异性分别为65%和90%, 而核心岩藻糖化GP73对肝癌诊断敏感性和特异性则高达90% 和100%。正常肝脏细胞几乎不表达GP73, 但在肝脏出现急性炎症或较严重的肝纤维化时GP73合成增加, 发展到肝硬化时其表达又进一步提高, 肝癌时表达达到高峰。GP73的表达与肝癌发生过程是紧密相关的, 有可能成为肝癌监测的候选标志物, 并且GP73在肝癌患者中的高表达与AFP水平无明显相关性, 糖基化的GP73很可能成为诊断肝癌的新标志物^[30]。

糖基化是蛋白翻译后修饰的最主要形式之一。糖链部分属于蛋白的高动态结构, 糖结构的变化即可能对蛋白功能有重要影响。蛋白聚糖类型合成取决于不同的器官、组织、细胞的生理、病理、分化和发育状态。蛋白的糖链结构分析, 对蛋白功能研究、蛋白在疾病诊断治疗中的应用十分重要。血清组分变化可充分反映机体生理、病理过程, 血清蛋白容易获取并易于监测, 故一直是肝癌诊断标志物的首选, 肝癌相关特定蛋白的特征性岩藻糖型改变可作为肿瘤标志物, 且此类蛋白水平和糖基化水平常与AFP水平不平行, 对AFP阴性或持续低浓度阳性肝癌患者诊断有着特殊意义。近期糖组方法学的发展已经让单个蛋白糖链结构精确分析成为可能, 蛋白糖基化修饰的功能研究、蛋白糖基化修饰对其配体结合的影响、蛋白相关糖谱库的建立、蛋白及其糖基化在肝癌等肿瘤疾病中的生物学功能和作用机制、蛋白糖基化在疾病诊断和治疗中的应用也是未来的主要研究方向。这些问题的阐述, 对肝癌进展的多分子机制从糖组学角度做出解释, 有望为包括肝癌在内的系列肿瘤诊断、治疗和预后判断提供新的手段。