支原体液体培养法假阳性原因探讨
支原体液体培养法假阳性原因探讨
作者简介：张红升,男,1969年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物学检验工作。
摘要
目的 探讨造成支原体培养假阳性的原因。方法 对1 640例泌尿生殖道分泌物进行支原体培养,并对支原体培养液加做细菌和真菌培养、计数及脲素、精氨酸分解试验。结果 626例变红的支原体阳性培养液中, 399例清晰的培养液在固体培养基上形成支原体典型菌落,而细菌和真菌浓度 ≤102 cfu/mL;227例混浊培养液中有170例长出支原体典型菌落,57例未见支原体生长,而培养出细菌和真菌106株,分离率为6.5%,假阳性率为3.5%。 当细菌或真菌浓度<103 cfu/mL时,培养液对细菌抑制明显,当细菌或真菌浓度≥103 cfu/mL时,细菌抑制效果不理想,培养液呈不同程度混浊或假阳性。结论 标本中如含大量分解脲素或精氨酸的细菌、真菌时,支原体培养基不能抑制其生长,可造成解脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)培养假阳性;当细菌或真菌浓度≥103 cfu/mL时,影响药物敏感性结果判断的准确性。
关键词:
支原体; 培养; 脲素; 假阳性
中图分类号:R446.5
文献标志码:A
文章编号:1673-8640(2012)04-0316-03
Keyword:
支原体可引起泌尿生殖道感染, 如宫颈炎、尿道炎、慢性前列腺炎等, 其中解脲脲原体(Uu)可引起精子畸形、早产、流产、死胎等[1], 检测支原体准确性对临床诊断和治疗有十分重要的意义。目前医院实验室普遍采用支原体液体培养法, 其方便、快捷、敏感性较高, 但仅适合Uu和人型支原体(Mh)培养, 不适合其他致病性支原体检测, 且每代生长时间约16 h。在支原体检测中, 单凭肉汤培养液颜色变化判断有无支原体生长, 容易受细菌、真菌干扰而造成假阳性结果[2]。为了解微生物对支原体液体培养结果的影响, 本研究对支原体培养液进行了培养。
材料和方法
一、材料
1. 标本 1 640例泌尿生殖道标本取自 2009年1月至2010年6月门诊妇产科、泌尿外科、性病科就诊的生殖炎症患者, 其中女性患者宫颈分泌物962份, 男性尿道分泌物678份, 标本采集后立即送检。
2. 试剂 支原体液体培养试剂盒由珠海迪尔生物工程有限公司生产。支原体固体琼脂、血琼脂培养基、氯化三苯四氮唑-沙氏培养基由杭州天和微生物试剂有限公司生产 。
二、方法
1. 支原体培养 支原体培养严格按照说明书进行无菌操作, 无菌采集标本后30 min内接种液体培养基, 37 ℃培养、计数及药物敏感性试验, 24 h判定Uu结果, 48 h判定Mh结果, 黄色为阴性, 红色为阳性。支原体培养液用0.45 μ m微孔滤膜过滤后接种支原体固体培养平板(含20%人血浆), 于37 ℃ 5%~10%二氧化碳条件下培养 2~7 d, 低倍镜下见到支原体典型菌落者为阳性。
2. 细菌、真菌培养 支原体培养液同时转种血平板、氯化三苯四氮唑-沙氏平板作病原菌分离, 同时取200 μ L培养液做细菌计数。分别于25 ℃真菌培养2472 h, 35 ℃细菌培养 18~24 h, 对所分离的细菌、真菌加做脲素、精氨酸分解试验, 细菌做常规鉴定[3]。
三、统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析, 计算男性、女性的检出率, 两者的比较采用χ 2检验, P< 0.05为差异具有统计学意义。
结 果
一、支原体液体培养基培养结果
1 640份首诊标本中支原体阳性 626例, 626例培养液颜色由黄变红, 其中 227份可见明显浑浊暂判为假阳性, 399份未见明显浑浊判为阳性, 未变色的 1 014份判为阴性。女性检出率明显高于男性(χ 2=3.07, P< 0.05)。见表1。
 | 表1 1 640份首诊标本支原体阳性率 |
二、支原体固体培养平板培养结果
液体培养液变红并明显浑浊的227例标本接种支原体固体平板培养, 有 170例长出支原体典型菌落, 57例未见支原体生长。液体培养液变红但未见明显浑浊的 399例标本转种固体平板培养, 有 399例长出支原体典型菌落。626例液体培养变红的标本共569例培养出支原体, 检出率为 34.7% (569/1 640), 假阳性率为3.5%(57/1 640)。
三、细菌检测结果
626例变红的液体培养基分别转种血平板、氯化三苯四氮唑-沙氏平板, 其中399例清晰的培养液细菌和真菌浓度均≤ 102 cfu/mL; 227例浑浊的培养液中, 共分离出细菌94株, 且细菌浓度≥ 103 cfu/mL, 分离率为5.7%(94/1 640), 其中大肠埃希菌34株, 变形杆菌12株, 肺炎克雷伯菌5株, 阴沟肠杆菌2株, 金黄色葡萄球菌11株, 表皮葡萄球菌27株, 其他阴性杆菌3株; 其中45株细菌可分解脲素, 引起Uu假阳性, 占Uu阳性率的10.1% (45/444); 12株细菌可分解精氨酸, 引起Mh假阳性, 占Mh阳性率的16.0% (12/75) ; 2株菌同时可分解脲素和精氨酸, 分离出2株细菌有2例标本。
四、真菌检测结果
227例浑浊的培养液中共分离出真菌12株, 且菌液浓度≥ 103 cfu/mL。其中白念珠菌7株, 热带念珠菌4株, 克柔念珠菌1株。克柔念珠菌分解脲素, 其他真菌均不分解脲素和精氨酸。
五、细菌计数检测结果
227例浑浊的培养液中, 细菌、真菌浓度< 103 cfu/mL 121例, 103~104 cfu/mL 36例, 104~105 cfu/mL 56例, ≥ 105 cfu/mL 14例。当细菌浓度≥ 103 cfu/mL时对支原体培养结果有影响, 且细菌浓度越高越容易导致支原体培养假阳性, 对药物敏感性试验结果判断也有不同程度的影响; 细菌浓度< 103 cfu/mL对支原体培养结果无影响。
讨 论
检测支原体的金标准是液体培养基和固体培养基相结合的方法[4] 。目前国内临床实验室普遍采用液体培养法检测泌尿系支原体。成品支原体肉汤培养液中均含有脲素、精氨酸和酚红指示剂。支原体在生长过程中分解脲素或精氨酸产碱, pH值上升, 肉汤培养液由黄色变红色判为阳性, 只要待检标本中存在分解脲素或精氨酸的微生物都有可能使支原体培养产生颜色变化, 这是液体培养法目前无法克服的缺点。对没有受到细菌污染的标本一般能得出正确结果, 但对受到能分解脲素或精氨酸细菌污染的标本容易产生假阳性结果。常规支原体液体培养液中有抑制剂, 可抑制标本中其他杂菌生长, 但抑制剂不能抑制所有微生物, 某些葡萄球菌、肠杆菌能分解脲素或精氨酸, 特别是随着细菌耐药性不断增强, 耐药谱发生变化[5], 混合感染中更容易出现药物的交叉耐药[6], 其如果不能被肉汤中的抑制剂所抑制, 在其生长繁殖过程中分解脲素或精氨酸, 就会导致支原体培养液变红, 从而造成支原体培养假阳性。
本研究结果显示, 变形杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌分解脲素是导致Uu培养假阳性的主要原因, 分解脲素占支原体培养阳性的2.7%(45/569)。支原体培养阳性标本中分离出细菌94株, 其中45株分解脲素产碱, 可导致Uu假阳性, 另12株分解精氨酸产碱, 可导致Mh假阳性, 占Mh阳性的2.1% (12/569), 此类细菌是造成支原体培养假阳性的主要原因。当细菌浓度≥ 103 cfu/mL时对支原体培养结果影响较大, 且细菌浓度越高越容易影响支原体培养对药物敏感性试验结果判断的准确性, 易判为假耐药; 菌液浓度< 103 cfu/mL对支原体培养结果一般无影响。分离的12株真菌, 以白念珠菌和热带念珠菌为主, 其中宫颈分泌物检出真菌的培养液中均有不同程度浑浊、沉淀, 因此采集标本时应避免接触阴道。真菌虽然不能分解脲素或精氨酸, 但也会干扰支原体结果的正确判断[5]。对女性培养结果影响较大的因素是表皮葡萄球菌和真菌; 对男性培养结果影响较大的因素是变形杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。
细菌由于能分解脲素或精氨酸产碱, 引起培养液变红, 易造成Uu和Mh假阳性, 因此无法判断是细菌和支原体混合生长, 还是只有细菌生长, 同时细菌生长对药物敏感性试验结果判断有一定的影响。分离出的念珠菌, 虽然很少分解脲素和精氨酸, 一般不会出现支原体假阳性, 但也会干扰药物敏感性试验结果的正确判断。当出现上述情况时, 应慎报结果, 有条件的医院应加做固体培养法试验以进一步确定。本研究结果提示, 采样时应尽量减少细菌、真菌污染, 避免对试验的干扰, 减少假阳性出现。为了提高支原体检测的准确性, 实验室检测支原体应以液体培养法和固体培养法相结合最佳, 或检测支原体的同时做细菌分离培养及脲素、精氨酸补充试验, 若发现分解脲素或精氨酸的细菌即判为污染, 结果慎报, 若有细菌生长, 而该菌不分解脲素或精氨酸或无细菌生长判为支原体阳性; 再者, 随着细菌耐药性不断增强, 耐药谱发生变化, 在支原体培养液中应加入对支原体无抑制作用的更广谱抗菌药物。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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