PCR检测分枝杆菌的敏感性和特异性依赖靶基因的选择, 不同目的基因的选择各有利弊, 以IS6110为检测目的基因存在一定的假阳性问题。目前, 已建立了针对不同靶基因的多重PCR法对其进行检测。Gupta等^[14]以hsp65、dnaJ和IS6110基因为靶基因采用多重PCR方法对收集的165份临床标本(包括痰、胸腹水、脑脊液、血、组织等)进行分子生物学鉴定, 并同时进行细菌培养及生化鉴定。结果表明, PCR法和细菌培养的阳性率分别为76.36%和57.57%。此多重PCR方法提高了诊断的阳性率, 可以鉴定结核分枝杆菌复合群(MTC)和NTM, 比单一基因PCR法具有更高的敏感性和特异性。

PCR-直接测序法是对特定的核苷酸靶序列进行分析, 是鉴定菌种的可靠而准确的方法。Ngan等^[15]以16S-23S rRNA 内转录间隔区(ITS)区为靶基因, 建立多重PCR法结合产物直接测序技术检测临床分离的NTM。作者针对缓慢生长型NTM(包括鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌)和快速生长型NTM(包括偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌)分别设计引物, 检测了临床分离的247株分枝杆菌, 结果显示敏感性和特异性均为100%。该方法可以实现对NTM快速准确的鉴别。

PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产生的技术, 是一种常见的微生物鉴定与分型方法。用相同的限制性内切酶消化不同微生物的DNA扩增片段后, 经琼脂糖凝胶电泳可得到特征性的限制性片段谱带, 通过对电泳图谱的分析可对病原体进行鉴定与分型。该法结合了PCR快速灵敏与RFLP准确、特异的优点, 成本低廉、结果稳定、操作简单, 结合软件可分析更为复杂的DNA电泳图谱。常用于PCR-RFLP法诊断分枝杆菌的种特异性保守序列有:IS6110、16S rRNA基因、16S~23S rRNA ITS区、hsp65基因、rpoB 基因等。(1)rpoB基因序列PCR-RFLP分析技术:万彦彬等^[16]以rpoB为靶基因设计分枝杆菌属特异性通用引物, 用限制性内切酶MspⅠ 对PCR产物进行酶切, 对酶切结果进行聚类分析, 建立鉴定分枝杆菌的PCR-RFLP方法, 具有良好的通用性和特异性。PCR-RFLP法鉴定98株分枝杆菌的结果与传统鉴定法完全一致, 其灵敏度、特异度和准确度均为100%, 方法学评价指标结果达到诊断性实验的要求, 为早期诊断结核病与NTM病提供了新的工具。Kim等^[17]采用双重PCR的方法, 以rpoB基因为靶基因设计引物, 分别扩增结核分枝杆菌(MTB)和NTM的235和136 bp的基因片段, 对44株分枝杆菌参考株和379株临床分离株进行检测, 并进一步对186株NTM选用限制性内切酶MspⅠ 、HaeⅢ 进行酶切鉴定和序列测定。结果表明, 该方法可以准确、快速的对MTB和NTM进行鉴别, 敏感性和特异性均为100%, 并能将NTM鉴定至种的水平; (2)hsp65基因序列PCR-RFLP分析技术:编码热休克蛋白的hsp65基因保守性较强, 存在于所有分枝杆菌中, 以hsp65基因作为PCR扩增的靶基因结合产物直接测序可以很好的将NTM鉴定到种, 克服了因扩增产物长度不够而难以对NTM种及亚种正确鉴定的缺陷。Kim等^[18]以hsp65基因作为靶基因, 采用双重PCR结合限制性酶切及测序分析鉴别MTB和NTM, 并能将NTM鉴定到种及亚种水平, 具有很好的敏感性和特异性。Shojaei等^[19]采用hsp65 PCR-RFLP、16S rRNA测序结合传统细菌培养的方法对67株临床分离的NTM进行菌种鉴定。PCR扩增644 bp的hsp65基因序列, 并用限制性内切酶AvaⅡ 、HphⅠ 、HpaⅡ 分别进行酶切鉴定, 该方法可以对NTM的流行情况及菌种分布特点进行监测, 有利于NTM病的防控及早期诊断。

由于MTC的16S rDNA 在123~276 bp完全相同, 而与其他22 种分枝杆菌存在几个碱基的差异。SSCP技术根据不同种的DNA单链的空间构象不同, 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率也不同, 从而呈现不同的谱带, 达到菌种鉴定的目的。靳晓红等^[20]用PCR-SSCP方法通过设计2对引物分别扩增16S rDNA 2条片段, 根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核分枝杆菌、NTB, 对98株临床分离株进行了分析。结果表明, 该方法对MTC及NTB的鉴别比细菌学方法快速, 仅用3 d, 且与细菌学方法具有良好的一致性。该方法可及时鉴别MTB与NTM, 对于临床复治、难治结核病的诊断及药物选择有重要作用。

PCR-核酸探针是PCR与DNA探针技术相结合对分枝杆菌进行鉴定的方法, 所用探针多为寡核苷酸探针, 杂交方法有斑点杂交法、反向斑点杂交法以及微杂交法等。原理是利用分枝杆菌特异的基因序列, 带上探针标记(如³²P同位素等), 来识别与之互补的特异基因序列, 从而区别MTB与NTM。亚能生物公司的分枝杆菌菌株鉴定基因检测试剂盒采用PCR-反向点杂交法, 根据16S rRNA序列设计出23种菌种特异的寡核苷酸探针, 与生物素标记的PCR扩增产物进行杂交, 通过膜条特定位置显色与否判断探针是否与该DNA片段杂交, 可以鉴定临床上23种常见的致病性分枝杆菌。比利时Innogenetics公司研制的INNO-LiPA分枝杆菌菌种鉴定试剂盒可鉴定16种分枝杆菌菌种。

基因芯片法是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上, 检测带标记的待测样品DNA, 与传统检测方法相比, 具有检测时间短、通量高等优点, 是一种大规模分析遗传差异的新方法。Park等^[21]基于ITS序列建立了寡核苷酸微阵列芯片法对分枝杆菌进行菌种鉴定, 采用1个属特异性探针和20个种特异性探针进行杂交, 可以对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、土地分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、母牛分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、猿分枝杆菌、溃疡分枝杆菌等20种分枝杆菌进行快速、准确的鉴定。作者对46株分枝杆菌参考株、149株临床分离株和155份临床标本进行寡核苷酸芯片检测, 整个检测程序(包括DNA提取、PCR扩增、DNA杂交及扫描分析)在4.5 h内完成, 结果表明该方法适用于常规实验室从临床分离株及临床标本中鉴定分枝杆菌, 具有快速、准确的特点。目前商品化的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒如博奥生物公司DNA微阵列芯片法可以快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌等17种临床常见分枝杆菌, 将常规的检测时间大大缩短, 在6 h内即可得到结果。

MIRU-VNTR方法是近年发展起来的以PCR为基础的DNA指纹识别技术之一。MIRUs与VNTRs是细菌基因分型有效的标记物, 以MIRU-VNTR为基础的分型方法依靠与位点侧翼区互补的寡核苷酸引物对不同位点进行PCR扩增, 由扩增产物的长度决定插入重复序列的拷贝数, 而重复序列的拷贝数在菌株中各有不同。MIRU是一类串联重复的序列。在结核分枝杆菌中共有41个MIRU位点, 通过特异扩增VNTR/MIRU位点所在的序列, 根据所得片段长度计算出重复单元的数目, 得出数字化的谱带。MIRU-VNTR方法已经广泛用于结核分枝杆菌的基因分型和分子流行病学研究, 其分辨能力随MIRU位点组成的不同和菌株来源而变化。Bull等^[22]将MIRU-VNTR分型方法用于MAC的基因分型。作者已证实在鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)和鸟亚种(MAA)中存在18个MIRU位点, 其中6个位点的重复序列的拷贝数在MAP 和MAA中是不同的。以4个MIRU位点为基础的PCR扩增可以将MAP分成2个基因型, 将MAA分成5个基因型。MIRU位点1或位点4的PCR扩增可以鉴别MAP和其他的MAC, 而1、4位点的PCR扩增可以鉴别MAP和胞内分枝杆菌。