引用本文
唐振华, 李柱南, 黄勇, 王进进, 胡伟平, 万小平. FHIT和 TSLC1基因在宫颈组织中的表达及其与HPV感染的关系 . 27(2): 91-94
TANG Zhenhua, LI Zhunan, HUANG Yong, WANG Jinjin, HU Weiping, WAN Xiaoping. Expressions of FHIT and TSLC1 genes in cervical tissues and relationship with HPV infection . Labratory Medicine, 27(2): 91-94  
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FHIT和 TSLC1基因在宫颈组织中的表达及其与HPV感染的关系
唐振华, 李柱南, 黄勇, 王进进, 胡伟平, 万小平
中国福利会国际和平妇幼保健医院检验科,上海 200030

作者简介：唐振华,男,1960年生,学士,副主任技师,主要从事临床微生物与免疫工作。

摘要
目的

检测宫颈组织脆性组氨酸三联体( FHIT)基因与肺癌肿瘤抑制因子1( TSLC1)基因表达,研究他们与宫颈癌发生及人类乳头瘤病毒(HPV)感染之间的关系。

方法

采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测正常宫颈组织20例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)20例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)45例及宫颈癌患者标本33例 FHIT基因及 TSLC1基因表达,同时检测这些标本中高危型HPV感染情况。

结果

正常宫颈组织、LSIL、HSIL和宫颈癌组织中HPV的感染率、 FHIT基因表达率及 TSLC1基因表达率分别为0%、30%、71%和100%,100%、80%、36%和18%以及100%、75%、33%和24%。3项指标在不同宫颈组织之间差异有统计学意义( P<0.01)。所有 FHIT基因与 TSLC1基因表达缺失的患者均存在高危型HPV感染。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明检测 FHIT与 TSLC1基因表达缺失对宫颈癌及HSIL具有诊断价值。

结论

FHIT基因与 TSLC1基因在HPV感染之后、宫颈癌发生过程的早期阶段就可能发生表达缺失。对高危型HPV感染者进行 FHIT与 TSLC1基因表达检测,有可能成为宫颈癌早期诊断的重要参考依据。

关键词: FHIT; TSLC1; HPV; 宫颈组织
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)02-91-04
Expressions of FHIT and TSLC1 genes in cervical tissues and relationship with HPV infection
TANG Zhenhua, LI Zhunan, HUANG Yong, WANG Jinjin, HU Weiping, WAN Xiaoping
Department of Clinical Laboratory, the International Peace Maternity and Child Health Hospital of the China Welfare Institute, Shanghai 200030, China
Abstract
Objective

To study the expressions of fragile histidine triad ( FHIT) gene and tumor suppressor in lung cancer 1 ( TSLC1) gene in cervical tissues and the relationship with the occurrence of cervical cancer and human papillomavirus (HPV) infection.

Methods

The FHIT and TSLC1 gene expressions and high-risk HPV were detected in normal cervical tissues (20 cases), low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) tissues (20 cases), high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) tissues (45 cases) and cervical cancer tissues (33 cases) by real-time polymerase chain reaction (PCR).

Results

The rates of HPV infection and FHIT and TSLC1 expressions in normal cervical tissues, LSIL tissues, HSIL tissues and cervical cancer tissues were 0%, 30%, 71% and 100%; 100%, 80%, 36% and 18%; 100%, 75%, 33% and 24%, respectively. Each of the 3 rates was significantly different between the different cervical tissues ( P<0.01). High-risk HPV infection was detected in all the patients with FHIT and TSLC1 gene expression loss. The receiver operating characteristic (ROC) curve analysis showed that detection of FHIT and TSLC1 gene expression loss had diagnostic values for cervical cancer and HSIL.

Conclusions

The losses of FHIT and TSLC1 gene expressions may occur at the early stage of cervical cancer after HPV infection. The detections of FHIT and TSLC1 gene expressions in patients with high-risk HPV infection may provide important markers for cervical cancer diagnosis.

Keyword: Fragile histidine triad; Tumor suppressor in lung cancer 1; Human papillomavirus; Cervical tissue
引言

宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染密切相关, 但HPV感染并不必然导致宫颈癌的发生。长期的跟踪研究表明, 感染高危型HPV的妇女只有一小部分发展成为宫颈癌[1]。抑癌基因失活与癌基因激活可能在宫颈癌发生中具有重要作用, 检测这些基因的表达情况有可能协助临床医生早期识别HPV感染患者的疾病发展方向, 为宫颈癌的早期诊断提供参考依据。脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)基因与肺癌肿瘤抑制因子1(tumor suppressor in lung cancer 1, TSLC1)基因是近几年发现的抑癌基因, 与宫颈癌的发生有密切关系[2, 3]。我们检测不同类型宫颈组织FHIT和TSLC1基因的表达及HPV感染情况, 研究其相互关系, 以期为宫颈癌的早期诊断提供依据。

材料和方法
一、 细胞株、病例及标本

宫颈癌细胞株(HeLa)由复旦大学遗传所惠赠。宫颈组织标本来自中国福利会国际和平妇幼保健院活检或手术患者, 宫颈癌患者33例(鳞癌29例, 腺癌4例), 高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)患者45例, 低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)患者20例。所有患者均经过细胞病理检测证实, 年龄3859岁。另有20例子宫肌瘤患者的正常宫颈标本作为对照。

二、 主要仪器与试剂

实时荧光聚合酶链反应(PCR)仪为美国应用生物系统公司Prism 7500; Trizol试剂购自Sigma公司; PCR反应体系购自TaKaRa公司; 高危型HPV DNA检测试剂由上海复星医学科技发展有限公司提供。

三、 引物与探针

引物与探针序列均采用Oligo 6.0 软件设计, 目的基因FHIT、TSLC1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物及探针序列如表1所示。

表1 引物与探针
四、 RNA提取

组织标本采用激光俘获显微切割方法分离约100 mg肿瘤细胞后进行研磨, 然后采用Trizol试剂提取mRNA, 按照说明书进行提取。细胞株直接采用Trizol试剂提取mRNA。提取的mRNA经不含RNA酶的DNase I消化后备用。

五、 反转录实时荧光PCR

FHIT mRNA、TSLC1 mRNA与内参照GAPDH mRNA分别进行扩增。在PCR反应体系中加入引物和探针各0.5 μ mol/L, mRNA模板5 μ L, 总反应体积为30 μ L。反应条件为:首先在42 ℃反转录 30 min, 95 ℃变性2 min, 然后95 ℃ 30 s, 55 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s扩增40个循环。在退火阶段采集荧光信号。采用Prism 7500专用软件进行数据分析。

六、 HPV检测

高危型HPV DNA采用实时荧光PCR法进行检测。该方法能够检测10种高危HPV亚型(16、18、31、33、35、45、52、53、56、58)。

七、 统计学方法

所有统计分析均采用SPSS16.0 软件进行。基因表达差异采用卡方检验或Fisher精确检验进行分析。

结果
一、HPV感染

不同宫颈组织HPV感染、FHIT及TSLC1基因表达情况如表2所示。正常宫颈组织、LSIL、HSIL和宫颈癌组织中高危型HPV的感染率分别为0%、30%、71%和100%, 各组之间差异有统计学意义(P< 0.01)。

表2 各种宫颈组织中10种高危型HPV感染、FHIT及TSLC1基因的表达
二、FHIT及TSLC1基因在宫颈组织中的表达

实时荧光PCR扩增曲线的阈值循环(thre-sholdcycle, Ct)值≤ 39判断为基因表达阳性, > 39则判断为基因表达缺失。以HeLa细胞为FHIT及TSLC1基因表达阴性对照, 正常组织细胞作为阳性对照。如果GAPDH检测阴性则对标本进行重复处理和检测。实验结果表明, FHIT基因在正常宫颈组织、LSIL、HSIL和宫颈癌组织中表达率分别为100%、80%、36%和18%, 各组之间差异有统计学意义(P< 0.01)。TSLC1基因表达率分别为100%、75%、33%和24%, 各组之间差异有统计学意义(P< 0.01)。但在相同类型的宫颈组织中, FHIT基因和TSLC1基因表达率差异无统计学意义。38例表达TSLC1基因的LSIL、HSIL和浸润癌患者有32例表达FHIT基因, 38例表达FHIT基因的宫颈病变患者中也有32例表达TSLC1基因。54例(55%)宫颈病变患者同时出现FHIT基因和TSLC1基因表达缺失。

三、FHIT、TSLC1基因表达与HPV感染的关系

所有FHIT基因或TSLC1基因表达缺失的标本均检测到高危型HPV感染。但10种高危型HPV感染的标本并不都出现FHIT基因或TSLC1基因表达缺失, 见表3。

表3 HPV阳性宫颈组织中FHIT及TSLC1基因的表达
四、联合检测FHIT与TSLC1基因表达缺失对宫颈癌的诊断价值

分别以宫颈癌患者, 宫颈癌与HSIL患者、宫颈癌及鳞状上皮内病变患者作为阳性, 以其他患者作为阴性, 根据FHIT与TSLC1基因表达缺失情况绘制受试者工作特征(ROC)曲线。 对不同类型的患者诊断价值如表4所示, 联合FHIT 与TSLC1基因表达同时缺失诊断不同类型宫颈病变的诊断指标如表5所示, 对宫颈癌、HSIL及LSIL诊断的ROC曲线如图1所示。

表4 检测FHIT与TSLC1基因表达缺失对宫颈病变的ROC曲线下面积
表5 FHIT 或TSLC1基因表达同时缺失诊断不同类型宫颈疾病的价值(%)

图1 FHIT 与TSLC1基因表达同时缺失诊断宫颈癌、HSIL及LSIL的ROC曲线

讨论

宫颈癌是妇科常见肿瘤之一, 发病率居妇科肿瘤第2位。宫颈癌早期治愈率很高, 但晚期治疗效果并不理想, 因此, 宫颈癌的早期诊断具有重要意义。HPV感染是诱发宫颈癌的最重要因素之一, 但仅仅HPV感染并不能直接诱发宫颈癌。HPV感染后导致和伴随的一系列遗传改变可能是宫颈癌发生过程中不可缺少的步骤。寻找合适的分子标记, 以便早期辨别HPV感染后是否能够发展成为宫颈癌, 是目前研究的热点领域之一。FHIT基因与TSLC1基因都是抑癌基因, 分别位于染色体3p14.2和11q23.2, 与多种肿瘤的发生都有密切关系, 在宫颈癌的发生过程具有重要作用[2, 3]。研究结果表明, 在宫颈肌瘤、LSIL、HSIL及宫颈癌组织中FHIT基因的表达率为100%、80%、36%、18%, TSLC1基因表达率为100%、75%、33%、24%。在相同类型的宫颈组织中两者的表达率差异无统计学意义。但随着疾病的进展, 2种基因的表达率都显著下降, 表明这2种基因的表达缺失与宫颈癌的发生有密切关系。另外, 在LSIL患者中2种基因都存在表达缺失, 说明这2种基因的表达缺失发生在宫颈癌发生的早期阶段, 有可能成为宫颈癌早期诊断的标志。我们的结果表明, 检测FHIT与TSLC1基因表达缺失对宫颈癌、宫颈癌与HSIL、宫颈癌及鳞状上皮内病变进行诊断时ROC曲线下面积分别为0.710、0.829及0.837, 诊断的准确性为中等。根据敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值的结果综合来看, 检测FHIT与TSLC1基因表达缺失对诊断宫颈癌及HSIL具有一定价值, 可以为临床诊断高级别宫颈病变提供一定参考。由于在相同类型的宫颈组织中2种基因的表达率差异无统计学意义, 表明这2种基因的表达缺失可能出现在宫颈癌发生的同一阶段, 但这一结论还有待于大标本研究进行进一步确认。另外, 2种基因表达缺失的主要原因都是启动子区域甲基化、杂合缺失和基因突变[4, 5, 6], 但是他们的表达缺失是独立发生还是协同作用, 还需要进一步研究。

HPV是宫颈癌的主要诱发因素, 检测HPV感染已经成为宫颈癌筛查、诊断和治疗监测的重要手段[7]。研究结果表明, 所有FHIT基因或TSLC1基因表达缺失的患者均受到高危型HPV的感染, 而HPV感染的患者并不是都出现这2种基因的表达缺失, 说明这2种基因的表达缺失是发生在HPV感染之后。由于这2种基因在许多非HPV感染的肿瘤中都出现表达缺失[8], 说明HPV感染并不是导致他们发生表观遗传学改变和表达缺失的直接诱因。从HPV感染到抑癌基因和癌基因发生变化可能还涉及到许多因素的参与。HPV感染后, 其E6、E7基因与人体基因的相互作用, 包括与抑癌基因p53等相互结合, 一直到其他抑癌基因的失活和癌基因的激活的具体过程目前还不清楚。进一步研究HPV感染后导致包括FHIT基因与TSLC1基因表达缺失在内的一系列分子病理学变化, 将有助于进一步理解宫颈癌的发生机理。

总之, FHIT基因与TSLC1基因在宫颈癌发生过程的早期阶段就可能发生表观遗传学改变而导致表达缺失。他们的表达缺失发生在HPV感染之后, 可能发生在宫颈癌进展的同一阶段, 但两者之间是否有协同作用还需要进一步研究。对高危型HPV感染者进行FHIT与TSLC1基因表达检测, 有可能为宫颈癌的早期诊断提供重要参考依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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