引用本文
尤海燕, 芮金兵, 焦志军, 李晶, 吴玲, 裘影影. 类风湿性关节炎患者外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞百分率的变化及意义 . 27(2): 138-140
YOU Haiyan, RUI Jinbing, JIAO Zhijun, LI Jing, WU Ling, QIU Yingying. Change and significance of CD3+CD(16, 56)+ natural killer T cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis . Labratory Medicine, 27(2): 138-140  
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类风湿性关节炎患者外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞百分率的变化及意义
尤海燕1, 芮金兵2, 焦志军1, 李晶2, 吴玲2, 裘影影2
1. 江苏大学附属医院检验科,江苏 镇江 212001
2. 江苏大学附属医院风湿科,江苏 镇江 212001

通讯作者：焦志军,联系电话：0511-85021135。

作者简介：尤海燕,女,1970年生,学士,副主任技师,主要从事免疫学实验工作。

基金:国家自然科学基金资助项目（30872335）; 江苏省卫生厅医学科技发展基金资助项目（H200950）; 镇江市社会发展基金资助项目（SH2008035）
摘要
目的

探讨CD3+CD(16、56)+ 自然杀伤(NK) T细胞在类风湿性关节炎(RA)患者外周血中的变化及意义。

方法

采用流式细胞术检测RA患者(病情活动组和病情稳定组)及健康人(对照组)外周血淋巴细胞中CD3+CD(16、56)+细胞的比例及CD3+CD(16、56)+淋巴细胞CD69的表达百分率。

结果

RA病情活动组外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞的比例及NK T细胞CD69的表达百分率明显低于RA病情稳定组及健康对照组( P均<0.01);RA病情稳定组NK T细胞的比例及NK T细胞CD69的表达百分率与健康对照组差异无统计学意义( P均>0.05)。

结论

RA患者外周血中CD3+CD(16、56)+NK T细胞比例减少及活性受抑制可能参与了RA的发病过程,且可能与RA的病情活动性相关。

关键词: 自然杀伤T细胞; 类风湿性关节炎; 流式细胞术
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)02-138-03
Change and significance of CD3+CD(16, 56)+ natural killer T cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis
YOU Haiyan1, RUI Jinbing2, JIAO Zhijun1, LI Jing2, WU Ling2, QIU Yingying2
1. Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Jiangsu University,Jiangsu Zhenjiang 212001, China
2. Department of Rheumatology, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu Zhenjiang 212001, China
Abstract
Objective

To investigate the change and significance of CD3+CD(16, 56)+ natural killer(NK) T cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis(RA).

Methods

The percentage of CD3+CD(16, 56)+ T cells and the expression of activation marker CD69 on CD3+CD(16, 56)+ T cells in peripheral blood lymphocyte from active and inactive RA patients and healthy subjects as controls were determined by flow cytometry.

Results

Compared with healthy controls and inactive RA patients, the active RA patients had a lower percentage of CD3+CD(16, 56)+ NK T cells and down-regulated expression of CD69 on CD3+CD(16, 56)+ NK T cells ( P<0.01). The percentage of NK T cells and CD69 expression on CD3+CD(16, 56)+ T cells had no statistical significance between healthy controls and inactive RA patients ( P>0.05).

Conclusions

Low percentage of CD3+CD(16, 56)+ NK T cells with down-regulated expression of CD69 in peripheral blood may play a potential role in the pathogenesy of RA and be relevant to the activity of RA.

Keyword: Natural killer T cell; Rheumatoid arthritis; Flow cytometry
引言

自然杀伤(natural killer, NK)T细胞是T细胞的一个亚群, 其特异标记为CD3+TCRVα 24+TCRVβ 11+, 其特征为既表达NK细胞表面抗原和受体又表达T细胞表面抗原和受体, 既有NK细胞的NK功能又有T细胞的免疫调节或细胞毒功能[1]。NK T细胞种类复杂, CD3+CD(16、56)+淋巴细胞是NK T细胞群体中的一员。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以关节的慢性炎症和骨质破坏为主要特征的自身免疫性疾病, 其发病机制与机体的免疫调节功能紊乱有关。NK T细胞作为一种特殊的免疫调节细胞, 其数量及功能的异常都可能参与RA的发病过程。本研究采用流式细胞术检测RA患者外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞的比例及NK T细胞的活化标志物CD69的表达情况, 并初步探讨CD3+CD(16、56)+NK T细胞数量及活性与RA发病之间的关系。

材料和方法
一、研究对象

45例乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝静脉血标本取自江苏大学附属医院就诊的RA患者, 其中活动期20例(女19例、男1例, 年龄1950岁)、稳定期25例(均为女性, 年龄2352岁)。RA诊断符合美国风湿病学会1987年分类标准。按照疾病活动性评分28(disease activity score 28, DAS28)来评估疾病活动性。DAS28将疾病的活动性分为4级, 即缓解(< 2.6)、轻度活动(2.63.2)、中度活动(3.25.1)和重度活动(> 5.1)[2]。选择初发的RA患者, 经DAS28评为轻度活动至重度活动者作为RA活动组(20例); 经治疗达缓解者作为RA稳定组(25例); 同时选年龄和性别相匹配的30名健康献血员作为健康对照组。

二、主要仪器和试剂

FACS Calibur流式细胞仪、红细胞裂解液、异硫氰酸(FITC)荧光素标记的鼠抗人CD3抗体、藻红蛋白(PE)荧光素标记的鼠抗人CD(16、56)抗体、别藻蓝蛋白(APC)荧光素标记的鼠抗人CD69抗体及相应的同型对照IgG1- APC均为美国BD公司产品。

三、方法

1. 细胞染色 取A、B 2支流式专用试管, A管为同型对照管, B管为测定管。2管中各加入100 μ L EDTA-K2抗凝全血、10 μ L CD3-FITC、10 μ L CD(16、56)-PE后, 再于A管中加入10 μ L IgG1- APC, 于B管中加入10 μ L CD69-APC后混匀, 室温避光反应15 min, 而后于2管中各加入1 mL 红细胞裂解液, 室温避光反应10 min后, 离心弃上清, 加入2 mL生理盐水洗涤1次后以300 μ L生理盐水重悬细胞, 进行流式细胞术测定。

2. 流式细胞术检测 用Cellquest软件获取、分析数据。 在前向散射光(FSC)-侧向散射光(SSC)点图上设门于淋巴细胞, 测定其中CD3+CD(16、56)+细胞的百分率。再设门于CD3+CD(16、56)+细胞, 测定其中CD69+细胞百分率。

四、统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件处理, 数据以 x-± s表示, 采用方差分析和q检验进行统计分析, 以P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果

RA活动组外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞比例[(3.01± 1.32)%]明显低于RA稳定组[(5.40± 2.62)%]和健康对照组[(6.95± 3.07)%, P均< 0.01]; RA活动组外周血NK T细胞中CD69+细胞比例[(4.83± 1.84)%]明显低于RA稳定组[(10.62± 2.33)%]和健康对照组[(12.07± 2.96)%, P均< 0.01]; RA稳定组外周血NK T细胞比例及NK T细胞中CD69+细胞比例与健康对照组差异无统计学意义(P均> 0.05), 见图1、图2。

图1 流式细胞仪检测CD3+CD(16、56)+NK T细胞注:a图为设门于淋巴细胞; b图为健康人CD3+CD(16、56)+NK T细胞; c图为RA患者CD3+CD(16、56)+NK T细胞

图2 流式细胞仪检测CD3+CD(16、56)+NK T细胞CD69的表达注:a图为设门于NK T细胞; b图为健康人NK T细胞CD69的表达; c图为RA患者NK T细胞CD69的表达

讨论

NK T细胞是近年发现的有着NK细胞受体及功能的T细胞亚群, 能被非经典的主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ 类分子CD1d提呈的糖脂抗原所激活, 活化后能迅速分泌大量的γ 干扰素(IFN-γ )、白细胞介素(IL)-4等辅助性T细胞(Th)1和Th2型细胞因子, 参与机体的免疫调节过程[3]。有研究发现, NK T细胞数量或功能的异常与1型糖尿病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生有关[4, 5]。

以往的研究认为, RA患者机体内Th1型免疫反应亢进、Th2型免疫反应受抑, 即Th1/ Th2细胞的平衡失调与RA的发生密切相关[6], 但其失衡机制尚不清楚。促炎性的Th1型细胞因子和抑炎性的Th2型细胞因子在生物学作用上相互拮抗, NK T细胞作为一种能同时分泌Th1和Th2型细胞因子的特殊调节T细胞, 有可能影响着Th1/ Th2细胞介导的免疫平衡。

本研究发现, RA活动组外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞比例显著低于RA稳定组和健康对照组。Linsen等[7]发现, RA患者外周血NK T细胞除数量减少外, 其分泌IL-4的能力也明显降低, 而IL-4是调控Th2型免疫反应的关键细胞因子, IL-4的降低可致Th2型免疫应答低下, 低水平的Th2型免疫应答不能抑制Th1型细胞介导的炎症反应, 从而出现Th1/ Th2的免疫失衡。同时我们发现, RA活动组外周血NK T细胞CD69的表达也低于RA稳定组和健康对照组。CD69是T细胞活化的标志分子, 也可用于评价NK T细胞的活性及评价其功能[8]。RA活动组外周血NK T细胞CD69的表达低下, 提示RA活动组外周血NK T细胞的活化比例可能处于受抑制状态。外周血NK T细胞数量减少、活化比例低下及功能降低可能是RA患者Th1/ Th2细胞平衡失调的重要原因。

NK T细胞在疾病中除通过优势分泌IFN-γ 或IL-4等细胞因子引起Th1/ Th2的平衡失调外, 还可通过表面分子和受体等进一步作用于NK细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、其他调节性T细胞、树突状细胞、中性粒细胞等免疫细胞, 致机体免疫耐受失衡而引起免疫损伤[9]。

总之, 外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞数量减少及活性受抑制可能在RA的发生中起作用, 且可能与RA的病情活动性相关。今后, 我们将就NK T细胞在RA患者发病机制中的作用作进一步的研究, 以期找到RA治疗的新靶点。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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