引用本文
杜岩青, 冯爽, 冯冉冉, 刘树业. T细胞斑点试验技术在结核性胸膜炎诊断中的价值. 2012, 27(11): 1070-1073
DU Yanqing, FENG Shuang, FENG Ranran, LIU Shuye. The significance of T-SPOT.TB test in the diagnosis of tuberculous pleurisy. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 1070-1073  
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T细胞斑点试验技术在结核性胸膜炎诊断中的价值
杜岩青1, 冯爽2, 冯冉冉2, 刘树业1
1. 天津医科大学第三中心临床学院,天津 300171
2. 天津市海河医院检验科,天津300330

作者简介:杜岩青,女,1983年生,学士,主要从事临床检验诊断学研究。

通讯作者:刘树业,联系电话:022-24384350。

摘要
目的

探讨结核分枝杆菌T细胞斑点试验 (T-SPOT.TB) 技术在结核性胸膜炎诊断以及鉴别诊断中的临床应用价值。

方法

受试者共124例,包括健康对照者30名、初诊结核性胸膜炎患者37例、恶性胸腔积液患者32例、非结核性胸膜炎患者25例。用T-SPOT.TB测试上述受试者的外周血单个核细胞(PBMC)中对结核分枝杆菌早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和/或培养滤液蛋白10(CFP-10)致敏的T细胞,并与其他相关指标[腺苷脱氨酶(ADA)、结核抗体(TB-Ab)、涂片]进行比较。

结果

结核性胸膜炎组T-SPOT.TB检测阳性率为91.9%,显著高于健康对照组(0.0%)、恶性胸腔积液组(9.4%)和非结核性胸膜炎组(8.0%),差异具有统计学意义( P<0.05)。T-SPOT.TB对结核性胸膜炎诊断的敏感性、特异性和诊断准确率分别为91. 9%、90.6%、91. 3%,优于ADA和TB-Ab。

结论

T-SPOT.TB可用于结核性胸腔积液的鉴别诊断。在诊断结核性胸膜炎时T-SPOT.TB获得了较高的敏感性、特异性和诊断准确率。T-SPOT.TB作为辅助诊断结核性胸膜炎的方法值得在临床推广及应用。

关键词: T细胞斑点试验; 结核性胸膜炎; 诊断
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)12-1070-04
The significance of T-SPOT.TB test in the diagnosis of tuberculous pleurisy
DU Yanqing1, FENG Shuang2, FENG Ranran2, LIU Shuye1
1.The Third Central Clinical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300171, China
2.Department of Clinical Laboratory,Haihe Hospital of Tianjin,Tianjin 300330,China
Abstract
Objective

To investigate the clinical application significance of Mycobacterium tuberculosis T cell enzyme-linked immunospot tuberculous test (T-SPOT.TB test) in the diagnosis and differentiated diagnosis of tuberculous pleurisy.

Methods

A total of 124 participants were enrolled in this study, including 30 healthy controls, 37 patients with tuberculous pleurisy, 32 patients with malignant pleural effusion and 25 patients with non-tuberculous pleurisy. The T cells to early secretary antigentic target 6 (ESAT-6) and/or culture filtrate protein 10 (CFP-10) sensitive in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) of participants were determined by T-SPOT.TB test. The results were compared with other related indicators [adenosine deaminase (ADA), tuberculosis antibody (TB-Ab) and smear].

Results

The positive rate of the tuberculous pleurisy group (91.9%) by T-SPOT.TB test was significantly higher than those of healthy control group (0.0%), malignant pleural effusion group (9.4%) and non-tuberculous pleurisy group(8.0%). The differences were statistically significant ( P<0.05). The sensitivity, specificity and diagnostic accuracy in the diagnosis of tuberculous pleurisy by T-SPOT.TB test were 91.9%, 90.6% and 91.3%, which were superior to ADA and TB-Ab.

Conclusions

T-SPOT.TB test is useful for the differentiated diagnosis of tuberculous pleural effusion. It has high sensitivity, specificity and diagnostic accuracy in the diagnosis of tuberculous pleurisy. Therefore, T-SPOT.TB test is worth in the clinical extention and application, and would be a supplement for the diagnosis of tuberculous pleurisy.

Keyword: T cell enzyme-linked immunospot tuberculous test; Tuberculous pleurisy; Diagnosis

结核性胸膜炎是胸腔积液的常见原因, 在我国胸腔积液住院患者中结核性胸腔积液占到49.5%~54.5%[1], 由于该病在临床上缺乏特异性表现, 用细菌学方法检测阳性率低, 胸膜活检的创伤性限制了其在临床的广泛应用, 分子生物学虽提供了快速诊断技术, 但仍存在假阳性及技术等方面的问题, 给初诊患者的确诊带来了一定难度, 故寻找一种敏感、特异的实验室诊断技术迫在眉睫。T细胞斑点试验 (T cell enzyme-linked immunospot, T-SPOT)由酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)技术发展而来, 本研究用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞(PBMC), 通过细胞因子γ -干扰素(IFN-γ )的分泌检测抗原特异性T淋巴细胞的应答反应, 据此判断结核分枝杆菌感染状态, 应用于结核性胸膜炎的诊断[2, 3]。

材料和方法
一、研究对象
1. 健康对照组

来天津市海河医院进行健康体检者共30名, 男15名, 女15名, 年龄15~32岁, 平均年龄(22.8± 3.1)岁。排除其他疾病, 既往身体健康, 否认结核病接触史, 无临床症状, 胸片无异常。

2. 恶性胸腔积液组

均经病理学或细胞学检查明确诊断为恶性胸腔积液者共32例, 男18例, 女14例, 年龄32~80岁, 平均年龄(53.7± 9.6)岁。无合并活动性肺结核或影像学未显示陈旧结核病变, 未接受放疗、化疗和手术, 未接受免疫增强剂治疗。

3. 结核性胸膜炎组

共37例, 男18例, 女19例, 年龄13~87岁, 平均年龄(36.5± 15.8)岁。诊断符合《结核病诊治指南》对结核性胸膜炎的诊断标准。

4. 非结核性胸膜炎组

共25例, 男15例, 女10例, 年龄24~77岁, 平均年龄(57.1± 10.2)岁。均为类肺炎性胸腔积液患者。

二、试剂和仪器

生物安全柜(Baker公司, 美国), CO2培养箱(三洋公司, 日本), 结核分枝杆菌T-SPOT(T-SPOT.TB)试剂盒(牛津Immunotec公司, 英国), 淋巴细胞分离液(GIBCO公司, 美国), 无血清培养液(AIMV, GIBCO公司, 美国), RPMI1640培养液(GIBCO公司, 美国), 腺苷脱氨酶(ADA)试剂(东瓯公司, 浙江), 仪器为UniCelDx C800全自动生化分析仪(贝克曼公司, 美国), 结核抗体(TB-Ab)试剂盒(OMEGA公司, 英国)。

三、T-SPOT.TB试验步骤

采集4 mL外周血标本置于肝素锂抗凝的试管中, 立即混匀, 在4 h内进行PBMC分离。离心管中预先加入4 mL RPMI1640液, 将混匀的4 mL抗凝全血加入离心管中混匀。另一离心管中预先加入3 mL淋巴细胞分离液, 将混匀的8 mL细胞悬液缓慢加入淋巴细胞分离液上方, 1 600× g离心22 min, 用加样器吸取白细胞层到15 mL离心管中。再加入RPMI1640 11 mL, 600× g离心7 min, 弃上清液。加入1 mL AIMV混匀细胞, 然后加至10 mL颠倒混匀。吸取10 μ L计数细胞(N)。通过计数的细胞数计算最后加入的AIMV量(V)V=N/25。计数细胞的同时, 将15 mL离心管350× g离心7 min沉淀细胞, 离心后倾去上清液, 加入计算好的AIMV量, 配置成细胞工作液。取出板条, 每份标本4孔, 孔中分别加入AIMV、抗原A[结核分枝杆菌早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)]、抗原B[培养滤液蛋白10(CFP-10)]、阳性对照50 μ L; 继在4孔中均加入细胞工作液100 μ L。 置CO2培养箱(37 ℃, 5%CO2, 保持湿度)温育16~20 h。次日取出温育板条, 倾去液体, 每孔用200 μ L磷酸盐缓冲液(PBS)清洗4次; 继加入50 μ L碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN-γ 单克隆抗体, 4~8 ℃温育1 h。取出, 倾去液体, 每孔用200 μ L PBS清洗4次; 继加入50 μ L显色底物, 室温暗处温育7 min。取出, 用自来水冲洗终止反应, 晾干2~3 h, 读取结果。

四、T-SPOT.TB结果判读

根据T-SPOT.TB 试剂盒使用说明书, 如果阴性对照孔斑点形成细胞(SFC)< 6, (检测孔SFC-阴性对照孔SFC)× 4≥ 24, 可判断所测标本为阳性; 如果阴性对照孔SFC≥ 6, 检测孔SFC为阴性对照孔2倍, 可判断所测标本为阳性。

五、标本其他指标参考值测定

胸腔积液ADA≥ 45 U/L为阳性, TB-Ab滴度> 400 U/mL为阳性。联合检测阳性病例指检测项目中至少有一项阳性。

六、统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析, 非正态分布的数据采用中位数表示, 组间SFC 数量比较应用Mann-Whitney U检验, 各组样本率的比较应用Pearson χ 2检验, P< 0.05为差异具有统计学意义。

结果
一、各组间SFC阳性率的比较

以ESAT-6抗原和CFP-10多肽抗原分别作为刺激物, 结核性胸膜炎组SFC阳性率显著高于健康对照组(P< 0.05)、恶性胸腔积液组(P< 0.05)和非结核性胸膜炎组(P< 0.05)。由于T-SPOT.TB试剂盒检测孔A(ESAT-6抗原作为刺激物)和检测孔B(CFP-10多肽抗原作为刺激物)使用的抗原不同, 引起的细胞免疫反应也不完全一致, 两者相互补充可显著提高检测的阳性率, 在结核性胸膜炎组, 2种抗原互补检测的阳性率增加到了91.9%, 显著高于健康对照组(0.0%)、恶性胸腔积液组(9.4%)和非结核性胸膜炎组(8.0%), 其差异均具有统计学意义(P< 0.05)。而健康对照组、非结核性胸膜炎组、恶性胸腔积液组相互比较, 差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 各组T-SPOT.TB检测SFC阳性率的比较(%)
二、各组间SFC 数量比较

无论以ESAT-6抗原还是CFP-10多肽抗原作为刺激物, 结核性胸膜炎组中的SFC数量都显著大于恶性胸腔积液组和非结核性胸膜炎组, 差异具有统计学意义(P< 0.01)。见表2。

表2 各组SFC数量比较[中位数(范围)]
三、T-SPOT.TB对结核性胸膜炎的诊断性能

T-SPOT.TB在结核性胸膜炎的诊断中敏感性91.9%、特异性90.6%、约登指数0.825、诊断准确率91.3%, 均高于单一抗原(ESAT-6抗原或CFP-10多肽抗原)的各项指标值。2种抗原比较, ESAT-6抗原的各项指标数均高于CFP-10多肽抗原, 两者互补可显著提高各项诊断指标的值。见表3。

表3 T-SPOT.TB检测在结核性胸膜炎诊断中的性能
四、各种试验项目诊断结核性胸膜炎的评价指标

胸腔积液中ADA及TB-Ab的水平对结核性胸膜炎的诊断有一定参考价值, 但二者的阳性检出率并不高, T-SPOT.TB在敏感性(91.9%)、特异性(90.6%)、约登指数(0.825)等各项诊断指标均高于ADA及TB-Ab, 抗酸杆菌涂片的特异性虽好(100.0%), 但其敏感性过低(16.2%)。综合考虑, T-SPOT.TB无论在敏感性还是特异性等各方面都较高。见表4。

表4 各种试验项目诊断结核性胸膜炎的性能比较
讨论

胸腔积液中查到抗酸杆菌、结核分枝杆菌培养阳性被认为是诊断结核性胸腔积液的金指标, 由于胸水涂片和培养的阳性率较低, 影像学缺乏特异性, 结核性胸膜炎的诊断常常十分困难。ADA和TB-Ab是辅助诊断结核性胸膜炎的常用指标, 但本研究结果显示, 无论是特异性、敏感性还是诊断准确率, 二者均低于T-SPOT.TB, 提示T-SPOT.TB在诊断结核性胸膜炎时优于其他常见的辅助指标。

T-SPOT.TB技术2001年由Lalvani等发明, 2005年12月该试验获得了美国食品药品管理局的最终批准, 用于结核感染的辅助诊断, 现已在英国、美国及澳大利亚等国家得到广泛应用。T-SPOT.TB检测原理基于以下2点:(1)在结核分枝杆菌中存在名为“ RD1” 的基因序列, 而在卡介苗菌株和绝大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏该序列[4]。RD1编码产生2种蛋白(ESAT-6和CFP-10), ESAT-6和CFP-10作为特异性抗原刺激机体T淋巴细胞成为致敏T淋巴细胞, 后者产生细胞因子IFN-γ ; (2)T-SPOT.TB是由ELISPOT发展而来的, ELISPOT是一种新型的酶免疫技术, 从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞, 每1个显色斑点代表1个结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞。根据斑点数可以判断体内是否存在针对结核分枝杆菌反应的效应T细胞, 并可计数T细胞的数量。本研究结果显示, T-SPOT.TB检测的SFC, 无论是阳性率还是斑点数量, 结核性胸膜炎组均高于其他组, 提示T-SPOT.TB在结核性胸膜炎中有一定的诊断价值。

结核、肿瘤及其他非结核性胸膜炎是引起渗出性胸腔积液最常见的原因, 良、恶性胸腔积液的鉴别也是临床上常常遇到的难题。本研究结果表明, T-SPOT.TB在结核性胸膜炎组中的阳性检出率远高于恶性胸腔积液组和非结核性胸膜炎组, 说明T-SPOT.TB在结核性胸膜炎与其他渗出性胸腔积液的鉴别诊断中具有较好的性能。

Lee等[5]对40例胸腔积液患者(19例确诊结核性胸膜炎)的胸腔积液和PBMC进行T-SPOT.TB检测, 结果显示胸腔积液的T-SPOT.TB结果诊断结核性胸膜炎的敏感性和特异性分别为94.7%、85.7%, 外周血的T-SPOT.TB结果诊断的敏感性和特异性为77.8%、90.5%, 本研究虽仅用外周血进行研究, T-SPOT.TB的敏感性为91.9%, 特异性为90.6%, 敏感性高于Lee等研究结果, 特异性与Lee等研究结果接近。尽管在结核性胸膜炎的诊断中, Losi等[6]认为胸腔积液中的单核细胞比外周血更有诊断价值, 但本研究结果显示, 外周血作为一项非创伤性的检查, 辅助诊断的价值还是很高的。

出现假阳性的原因可能是患者曾经有过结核分枝杆菌的潜伏性感染, 亦不排除肿瘤和结核病同时感染的可能。出现假阴性的原因可能是该患者年纪较大, 细胞免疫功能缺陷所致。

综上所述, 对T-SPOT.TB检测结核性胸膜炎的优点总结如下:(1)体外试验, 检测快速, 全过程24~48 h; (2)高特异性, 所有卡介苗均缺失RD1基因, 且大多数环境分枝杆菌也缺乏RD1基因, 因此不受卡介苗接种的影响, 交叉反应少, 具有高特异性; (3)高敏感性, 可以检测单个反应细胞, 能从60 000个分泌IFN-γ 的细胞中测出1个细胞, 即使免疫功能低下的患者, 只要有单个的淋巴细胞反应, 就同样可以被检出; (4)可用于鉴别结核性胸腔积液。因此T-SPOT.TB作为辅助诊断结核性胸膜炎的方法值得在临床推广及应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[4] Codecasa L, Mantegani P, Galli L, et al. An in-house RD1-based enzyme-linked immunospot-gamma interferon assay instead of the tuberculin skin test for diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(6): 1944-1950. [本文引用:1]
[5] Lee LN, Chou CH, Wang JY, et al. Enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in the diagnosis of tuberculous pleurisy[J]. Clin Microbiol Infect, 2009, 15(2): 173-179. [本文引用:1]
[6] Losi M, Bossink A, Codecasa L, et al. Use of a T-cell interferon-gamma release assay for the diagnosis of tuberculous pleurisy[J]. Eur Respir J, 2007, 30(6): 1173-1179. [本文引用:1]