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侯彦强, 梁冬雨, 彭亮, 娄晓丽, 刘涛, 陈洪卫. 分支链DNA Alu技术定量检测败血症患者血浆循环DNA的表达. 2012, 27(11): 1050-1053
HOU Yanqiang, LIANG Dongyu, PENG Liang, LOU Xiaoli, LIU Tao, CHEN Hongwei. bDNA-based Alu quantitative assay of plasma cell-free DNA level in sepsis patients. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 1050-1053  
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分支链DNA Alu技术定量检测败血症患者血浆循环DNA的表达
侯彦强, 梁冬雨, 彭亮, 娄晓丽, 刘涛, 陈洪卫
上海交通大学附属第一人民医院松江分院检验科,上海 201600

作者简介:侯彦强,男,1971年生,博士,副主任技师,主要从事临床感染免疫基础及检验研究。

基金:上海市科委基金资助项目(12ZR1428200)
摘要
目的

探讨血浆循环DNA(cf-DNA)水平定量检测在败血症诊断和败血症与全身炎症反应综合征(SIRS)鉴别诊断中的价值。

方法

利用分支链DNA Alu技术定量检测24例败血症患者、43例SIRS患者和73名健康人血浆cf-DNA的表达水平;绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估血浆cf-DNA的临床价值。

结果

正常对照组血浆cf-DNA表达水平为68.56(12.56~309.78) ng/mL,SIRS组为609.67(15.98~2 596.87) ng/mL,败血症组为1 398.96(19.28~2 987.56) ng/mL,败血症组明显高于正常对照组( P<0.001)和SIRS组( P<0.001)。SIRS组与正常对照组、败血症组与正常对照组、败血症组与SIRS组的曲线下面积(AUC)分别为0.763 (0.661~0.865)、0.955 (0.884~1.025) 和0.777 (0.663~0.891)。

结论

血浆cf-DNA具有作为新的败血症诊断标志物的临床应用价值。

关键词: 循环DNA; 分支链DNA Alu技术; 标记物; 败血症; 诊断
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)12-1050-04
bDNA-based Alu quantitative assay of plasma cell-free DNA level in sepsis patients
HOU Yanqiang, LIANG Dongyu, PENG Liang, LOU Xiaoli, LIU Tao, CHEN Hongwei
Department of Clinical Laboratory, Songjiang Hospital Affiliated to First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 201600, China
Abstract
Objective

To investigate the significance of plasma cell-free DNA (cf-DNA) in diagnosis of sepsis and differential diagnosis between sepsis and systemic inflammatory response syndrome (SIRS).

Methods

The plasma cf-DNA of 24 sepsis patients, 43 SIRS patients and 73 healthy controls were detected by bDNA-based Alu quantitative assay. Receiver operating characteristic (ROC) curve was performed to evaluate the clinical significance of plasma cf-DNA.

Results

The plasma cf-DNA significantly increased in sepsis patients compared with in SIRS patients and healthy controls [1 398.96(19.28-2 987.56) ng/mL, 609.67(15.98-2 596.87) ng/mL and 68.56(12.56-309.78) ng/mL, respectively, P<0.001]. The areas under the ROC curve (AUC) of cf-DNA for the SIRS patients with healthy controls, sepsis patients with healthy controls and sepsis patients with SIRS patients were 0.763(0.661-0.865), 0.955 (0.884-1.025) and 0.777 (0.663-0.891), respectively.

Conclusions

Plasma cf-DNA has a clinical significance as a new biomarker for the diagnosis of sepsis.

Keyword: Cell-free DNA; bDNA-based Alu quantitative assay; Biomarker; Sepsis; Diagnosis

败血症(sepsis)是一类因多种病原菌进入机体血液系统后迅速繁殖、产生大量毒素, 机体受激发产生过度的炎症反应。目前败血症是重症监护病房(ICU)患者死亡的一个重要原因, 据统计, 在西方发达国家每年大约有150万人患病, 死亡率高达30%~50%[1, 2]。败血症死亡率高的主要原因之一是因为缺少理想的实验诊断指标, 早期诊断困难, 阻碍了早期有效的抗菌药物治疗。血液培养病原菌是目前诊断败血症的“ 金标准” , 但此方法检测时间长, 对血液样本要求较高, 阴性结果并不能完全排除败血症感染[3]。循环DNA(cell-free DNA, cf-DNA)是存在于血液(血浆或血清)、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA, 近年研究发现, cf-DNA在正常人中含量很少, 但在炎症、肿瘤和自身免疫性疾病中表达升高[4, 5]。实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)是目前最常用的cf-DNA检测方法, 但该方法存在样本要求高、操作复杂、技术要求高等缺陷和不确定性因素。本研究以人基因中最丰富的重复序列Alu为靶基因, 采用先进的分支链DNA技术定量检测血浆cf-DNA在败血症患者中的表达, 探讨血浆cf-DNA在败血症中的临床应用价值。

材料和方法
一、研究对象

选取上海交通大学附属第一人民医院松江分院2009年1月至2011年6月ICU住院的败血症患者24例, 其中男15例, 女9例, 年龄(58.3± 12.7)岁, 病因主要为手术、肠梗阻、肠穿孔等。24例患者中, 血培养结果病原菌感染革兰阴性菌阳性13例(大肠埃希菌8例, 肺炎克雷伯菌3例, 铜绿假单胞菌2例), 血培养革兰阳性菌阳性8例(金黄色葡萄球菌5例, 表皮葡萄球菌3例), 真菌感染3例(白念珠菌2例, 克柔假丝酵母1例)。另选取43例全身炎症反应综合征(SIRS)患者和73名健康人作对照组。SIRS患者均未发生器官功能障碍且均非由感染引起, 男26例, 女17例, 年龄(55± 11)岁。正常对照组中男45名, 女28名, 年龄(53± 13)岁。以上病例均在使用抗菌药物治疗前采集样本。

二、试剂与仪器

基因定量试剂盒(QuantiGene 2.0 Assay kit)购于Affymetrix公司; PE VicTor3 V酶标仪购自美国PerkinElmer公司; SHELLAB孵育箱购于美国SHELLAB公司。

三、样本采集和保存

采集空腹静脉血3 mL, 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝, 3 000× g离心10 min, 吸取上清于1.5 mL微量离心管中16 000× g离心10 min, 吸取血浆层, -80 ℃保存备用。

四、cf-DNA检测

采用分支链DNA Alu技术检测血浆cf-DNA, 严格按照试剂盒操作步骤进行检测, 简要步骤如下:(1) DNA标准品和待测样本准备。人DNA标准品1∶ 1对比稀释, 终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0 ng/mL; 将待测样本用双蒸水稀释20倍, 190 μ L双蒸水加入10 μ L待测血浆; 将标准品、样本100 ℃加热5 min后, 立即置于冰水中冷却备用; (2) 加20 μ L处理后的标准品、样本和80 μ L工作液(包含裂解液、人Alu的CE、LE探针、封闭液、蛋白酶K等)(Panomics, SantaClara, CA)于预包被人寡核苷酸捕获探针的96孔板中, 55 ℃孵育12~18 h, 洗液(0.1× 含有0.3 g/L柠檬酸锂十二烷基硫酸盐的标准盐水)洗涤3次; (3) 加入100 μ L前置放大分子(pre-amplifier)工作液(Panomics, SantaClara, CA), 55 ℃孵育1 h, 洗液洗涤3次; (4) 加入100 μ L放大分子(amplifier)工作液(Panomics, SantaClara, CA), 55 ℃孵育1 h, 洗液洗涤3次; (5) 加入100 μ L 3'端连接碱性磷酸酶的标记探针(label probe)工作液(Panomics, SantaClara, CA), 55 ℃孵育1 h, 洗液洗涤3次; (6) 加入100 μ L碱性磷酸酶底物(Panomics, SantaClara, CA), 室温反应 5 min; (7) Perkin Elmer Victor3 V酶标仪上检测分析。

五、分支链DNA Alu方法学评价

使用美国Promega公司的人基因组DNA来评价该方法的准确性、线性范围以及最低检出值。结果显示在0~400 ng/mL DNA浓度范围内, 回归线性方程为Y=1 778.9X, r2=0.992。最低检出限为0.86 ng/mL。准确性达93.35%~115.76%。

六、统计学方法

使用SPSS 13.0软件进行数据分析。数据用中位数(范围)表示, 采用非参数Mann-Whitney方法比较2组间差异; 采用受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)分析评估血浆cf-DNA对败血症的诊断及与SIRS的鉴别诊断价值。P< 0.05为差异有统计学意义。

结果
一、血浆cf-DNA检测结果

利用人DNA标准品绘制cf-DNA标准曲线, 从100 ng/mL 1∶ 1对比稀释人DNA标准品, 结果显示相关系数r2为0.999 1, 线性方程Y=2× 10-5X-0.031 2, 见图1。正常对照组血浆cf-DNA表达水平为68.56(12.56~309.78) ng/mL, SIRS组为609.67(15.98~2 596.87) ng/mL, 败血症组为1 398.96(19.28~2 987.56) ng/mL。败血症组血浆cf-DNA表达水平明显高于正常对照组和SIRS组(P< 0.001); SIRS组明显高于正常对照组(P< 0.001), 见图2。

图1 cf-DNA检测标准曲线

图2 血浆cf-DNA检测结果

二、血浆cf-DNA表达水平对败血症诊断和鉴别诊断价值

绘制ROC曲线评估血浆cf-DNA的临床价值。SIRS组与正常对照组、败血症组与正常对照组、败血症组与SIRS组的AUC分别为0.763(0.661~0.865)、0.955(0.884~1.025)和0.777(0.663~0.891)。血浆cf-DNA诊断败血症的最佳临界值为385 ng/mL, 敏感性为91.7%, 特异性为98.6%。血浆cf-DNA鉴别诊断败血症和SIRS的最佳临界值为522 ng/mL, 敏感性为91.7%, 特异性为60.5%。见图3。

图3 血浆cf-DNA诊断及鉴别诊断败血症的ROC曲线

讨论

败血症是由感染引起的全身炎症反应, 其临床症状是非特异性的, 与SIRS十分相似, 由于缺少理想的实验诊断指标, 败血症诊断及鉴别诊断困难, 容易延误治疗, 造成死亡率一直居高不下。目前临床用于诊断败血症的实验室指标主要包括C反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )和降钙素原(PCT)等, 但因在诊断的特异性和敏感性方面存在不足, 这些指标都不是理想的诊断标志物[6, 7, 8]。PCT被认为是目前最好的败血症实验室诊断标志物, 但其在败血症诊断、预后及与SIRS的鉴别诊断方面的价值并不十分理想[9, 10, 11], 最近有研究者利用meta分析, 统计分析了18篇PCT作为败血症实验诊断标志物的论文, PCT敏感性和特异性的平均值均只有71%[95%可信区间(CI) 67~76], AUC为0.78(95% CI 0.73~0.83)[12]。Pierrakos等[13]对3 370篇文献中的178个败血症诊断标志物进行分析, 也得出了类似的结论, 认为PCT在败血症的鉴别诊断和预后方面存在不足。因此, 急需寻找新的败血症标志物。

分支链DNA技术是一种不依赖PCR扩增的核酸杂交信号放大检测技术, 该技术克服了传统的实时PCR技术中的缺陷与不确定因素, 无需抽提纯化RNA, 无需反转录, 无需PCR扩增, 只要将样本用特定裂解液裂解后, 经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果[14]。在人类的基因组中有一种中等重复序列, 长约300 bp, 30万个成员分散分布在单倍体基因组中, 在其170 bp处有一个限制性酶AluI的酶切位点, 故称这个重复序列为Alu基因家族(Alu family), 大约平均每隔6 kb左右就有1个Alu序列, 在哺乳动物体内含量最丰富, 同源性最高, 因此其可作为人类DNA片段的特异标记。本研究中, 我们以Alu为靶基因, 利用分支链DNA技术检测循环DNA的表达。本研究结果显示, 败血症患者血浆cf-DNA水平明显高于SIRS患者和正常人(P< 0.001), ROC曲线分析发现, 血浆cf-DNA指标对败血症具有较高诊断价值(AUC=0.955), 当最佳临界值为385 ng/mL时, 敏感性为91.7%, 特异性为98.6%; 对于败血症与SIRS的鉴别诊断, 血浆cf-DNA指标同样表现出较高的应用价值, AUC为0.777, 最佳临界值为522 ng/mL, 敏感性为91.7%, 特异性为60.5%。

关于cf-DNA的确切来源尚未阐明, 目前主要有2种观点:一是认为细胞凋亡或坏死时细胞释放DNA至外周血中; 二是细胞主动分泌释放DNA到外周血, 如肿瘤细胞[15]。近来有研究发现, cf-DNA的水平与肿瘤细胞数量并不一致, 说明cf-DNA不仅来自于肿瘤细胞, 其他细胞在应激条件下也可能分泌cf-DNA[16]。对于败血症循环DNA升高的机制, 主要应该是败血症导致大量细胞凋亡、坏死所致, 因为近年来大量研究证实, 凋亡在败血症的发病机制中起到重要作用, 凋亡使免疫细胞和非免疫细胞功能缺失, 进而导致免疫抑制和多器官功能衰竭[17, 18]。

综上所述, 本研究利用先进的分支链DNA Alu技术研究发现, 血浆cf-DNA在败血症的诊断和鉴别诊断中表现出较高的应用价值, 具有作为新的败血症诊断标志物或辅助指标的临床价值, 有待于进一步深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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