引用本文
王丽娜, 李晓斐. 乙型肝炎病毒YMDD变异与原发性肝癌相关性研究. 2012, 27(11): 1047-1049
WANG Lina, LI Xiaofei. Correlation study on hepatitis B virus YMDD variation in primary hepatic carcinoma. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 1047-1049  
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乙型肝炎病毒YMDD变异与原发性肝癌相关性研究
王丽娜, 李晓斐
青岛市传染病医院检验科,山东 青岛 266033

作者简介:王丽娜,女,1978年生,硕士,技师,主要从事分子生物学研究。

摘要
目的

探讨原发性肝癌与乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的关系。

方法

应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术检测HBV YMDD变异情况,结合血清生化指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST),分析慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)各组变异与肝癌有无相关性。

结果

HCC组、LC组、CHB组HBV YMDD变异率分别为11.67%(7/60)、31.67%(19/60)、26.67%(16/60)。HCC组、LC组及CHB组中ALT活性分别为56(25~113)、61(23~301)、58(31~267)U/L,而AST活性分别为105(39~137)、64(25~109)和55(33~214)U/L。60例HCC患者中有HBV YMDD突变7例,突变率为11.67%。

结论

肝癌发生与HBV YMDD变异不存在明显相关性。AST比ALT更能反应HBV引起肝脏损伤的严重程度,而ALT是与HBV YMDD变异有关的较为敏感的肝功能指标,有利于病情监测。

关键词: YMDD变异; 乙型肝炎病毒; 聚合酶链反应; 原发性肝癌
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)12-1047-03
Correlation study on hepatitis B virus YMDD variation in primary hepatic carcinoma
WANG Lina, LI Xiaofei
Department of Clinical Laboratory, Qingdao Infection Disease Hospital, Shandong Qingdao 266033, China
Abstract
Objective

To investigate the correlation of primary hepatic carcinoma and hepatitis B virus (HBV) YMDD variation.

Methods

By real-time fluorescence polymerase chain reaction (PCR), the detection of HBV YMDD variation was performed. Combined with the results of serum biochemical markers, alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), the correlation of primary hepatic carcinoma with chronic hepatitis B (CHB), liver cirrhosis (LC) and hepatocellular carcinoma (HCC) was analyzed.

Results

In HCC group, LC group and CHB group, HBV YMDD mutation rates were 11.67% (7/60), 31.67% (19/60) and 26.67% (16/60). In HCC group, LC group and CHB group, the activities of ALT were 56(25-113), 61(23-301) and 58(31-267) U/L, and the activities of AST were 105(39-137), 64(25-109) and 55(33-214) U/L. In 60 cases of HCC, 7 cases showed positive HBV YMDD mutations, and the mutation rate was 11.67%.

Conclusions

The occurrence of primary hepatic carcinoma and HBV YMDD variation does not exist significant correlation. AST can reflect the severity of liver injury induced by HBV better than ALT. ALT is a sensitive indicator of liver function associated with HBV YMDD variation, and is conducive to disease monitoring.

Keyword: YMDD variation; Hepatitis B virus; Polymerase chain reaction; Primary hepatic carcinoma

原发性肝癌是我国常见肿瘤之一, 亦称肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC), 其恶性程度高, 死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第3位[1]。乙型肝炎病毒(HBV)持续感染与HCC的发生存在密切联系, 然而感染HBV的患者发展成为HCC的具体原因并不清楚, 其发生是多阶段、多因素和多基因的协同作用, 经历启动、促癌和演进等步骤[2]。HBV YMDD变异检测为临床用药和拉米夫定治疗效果监测提供了重要依据。目前的研究主要集中在核苷类似物治疗慢性肝炎、乙型肝炎肝硬化以及治疗后HBV YMDD变异方面。而HBV YMDD变异对原发性肝癌的影响尚待研究。

材料和方法
一、标本来源

自2006年7月至2010年12月青岛市传染病医院门诊就诊及住院治疗的HCC患者血清标本60例(HCC组, 未服用拉米夫定), 对照组HBV阳性的肝硬化(LC)患者标本60例(LC组, 应用抗病毒药物1年以上)和临床怀疑为拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清标本60例(CHB组, 应用抗病毒药物1年以上)。其中男141例, 女39例, 年龄20~65岁。临床诊断符合2001 年第八届全国肝癌学术会议修订的原发性肝癌诊断标准及2000年西安会议制定的乙型肝炎LC诊断标准。

二、方法及试剂

1.HBV 变异检测

采用HBV YMDD突变型核酸检测试剂盒, 按常规提取HBV DNA, 然后加入HBV突变聚合酶链反应(PCR)反应液进行扩增, 扩增条件为:37 ℃ 3 min, 92 ℃ 1 min, 93 ℃ 2 s, 42 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环, 37 ℃ 3 min。经PCR 扩增后, ROCHE LIGHTCYCLE 按照阳性对照自动进行结果分析。HBV DNA 变异检测试剂由凯杰生物工程(深圳)有限公司提供。

2.血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性测定

采用OLYMPUS AU2700生化分析系统及上海科华生物工程股份有限公司的ALT、AST检验试剂, 用速率法测定ALT和AST活性。

三、 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。正态分布数据采用 x̅± s表示, 应用t检验进行统计, 非正态分布数据以中位数(范围)表示, 采用非参数检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、HCC患者血清HBV YMDD变异检测

60例HCC患者血清中HBV YMDD变异7例, YIDD变异6例, YVDD变异1例, 变异率为11.67%。

二、各组血清HBV YMDD变异率比较

对HCC组、LC组、CHB组分别进行HBV YMDD变异检测, 变异率分别为11.67%(7/60)、31.67%(19/60)和26.67%(16/60)。见表1。各组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。

三、各组AST、ALT活性比较

HCC组、LC组和CHB组中ALT都保持较高的活性, 达到正常值(0~40)上限的1.5倍以上, 3组之间差异无统计学意义(P> 0.05); HCC组中AST则比LC组和CHB组都高(P< 0.01), 见表1。HCC组中AST大幅度升高, 说明肝细胞发生了严重损伤。

表1 各组中HBV YMDD变异及转氨酶活性比较
四、CHB组中HBV YMDD变异与肝功能的关系

CHB组中YMDD突变株ALT和AST活性明显比YMDD野生株强(P< 0.01), 突变株ALT和AST分别为野生株的2.48倍和1.87倍, 见表2。说明HBV YMDD变异产生后, HBV为逃避抗病毒药物的作用, 复制产生更多的病毒颗粒, 进而感染更多的肝细胞, 使肝内环境稳态进一步被打乱, 肝细胞负担增加。

表2 CHB组中HBV YMDD野生株和突变株肝功指标比较
讨论

HBV YMDD变异主要有YVDD和YIDD 2种, 由于HBV YMDD的高复制性以及病毒多聚酶错配率较高[3], 复制过程中就会出现HBV变异株, 并且YMDD变异株和野毒株的传播途径相同, 但变异株的复制能力较低, 使其低于检出水平。有研究发现, 未经药物治疗的CHB患者血清中可检测到YMDD变异株[4]。现有的研究表明, 在药物选择性作用下, 多聚酶变异耐药增强了病毒复制能力[5], 变异株不断进化, 变成优势病毒株, 从而使其高于检出水平出现变异。本研究结果表明, 60例HCC患者血清中HBV YMDD变异7例, YIDD变异6例, YVDD变异1例, 变异率为11.67%, 出现这种现象的原因可能是由于YVDD变异病毒复制能力比YIDD变异病毒强, 而且YVDD变异病毒的结构可能更稳定[6]。

HCC是我国的常见肿瘤之一, 其恶性程度高, 死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第3位, 仅次于胃癌和食道癌。目前HCC病因远未澄清, 但多数学者认为是基因、环境因素共同作用和影响的结果[7], 流行病学调查显示慢性HBV感染与HCC的发生有明确的关系。但感染HBV的患者发展成HCC的原因尚不清楚。由于HCC、LC、CHB患者存在细胞免疫功能受抑现象, 这使HBV在体内长期存在, 难以清除, 有利于HCC的发生和发展[8], 然而YMDD变异与HCC发生不存在统计学关系。YMDD基因序列位于HBV多聚酶基因中[9], 对HBV DNA的复制起重要作用。我们从HBV YMDD变异的角度, 探讨HBV与HCC发生的关系。YMDD变异结果表明, 60例HCC患者血清有7例发生变异, 变异率为11.67%, HCC组与对照组(LC组和CHB组)间的变异率差异无统计学意义(P> 0.05), 说明YMDD变异的发生与肝癌不存在明显相关性。

ALT和AST升高是肝病患者肝炎活动、肝功能受损的重要标志。80%的AST存在于线粒体中, 其增加说明肝细胞能量转换系统损伤, 在HCC组中AST大幅升高, 表明其肝细胞能量转换系统严重受损, 所以AST能较好地反映HBV引起的肝脏损坏程度。HCC、LC及CHB各组中ALT都保持了较高的活性, 但差异无统计学意义(P> 0.05), 说明各组患者均有不同程度的肝功能损伤。CHB组中YMDD变异组与野生组相比, 肝功能指标(AST、ALT)的活性显著增加, 其原因可能是YMDD变异后, 治疗药物对变异的HBV失去原有的治疗作用, 从而使变异株病毒滴度升高, 更多的病毒颗粒作用于肝细胞, 肝细胞病理状态进一步恶化, 病情加重。ALT和AST都显著地增加, ALT比AST增加更快, 说明YMDD变异后, 肝脏病理损伤迅速增加, 同AST相比, ALT更灵敏地反映了肝脏的功能损伤情况, 所以ALT是用药过程中与YMDD变异有关的更为敏感的肝功能指标。因此, HBV相关的肝病患者在应用抗病毒药物治疗过程中一定要监测病毒耐药性和肝功能指标的变化, 以防止出现病情恶化。综上所述, YMDD变异与HBV肝癌的发生无关, 但YMDD变异发生后, 变异株病毒复制增加, 逃避了抗病毒药物的作用致使病情加重。

另外, 我们应就HBV感染自然病程中HBV YMDD变异的发生和发展以及对临床产生的影响进行更深入的探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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