引用本文
朱继文, 张道纪, 阎红, 韩俊岭. 外周血检测miR-21方法的建立及在支气管哮喘中的应用. 2012, 27(11): 1043-1046
ZHU Jiwen, ZHANG Daoji, YAN Hong, HAN Junling. Establishment of a method for peripheral blood miR-21 detection and its primary application in bronchial asthma determination. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 1043-1046  
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外周血检测miR-21方法的建立及在支气管哮喘中的应用
朱继文1, 张道纪2, 阎红3, 韩俊岭2
1.泰兴市第二医院检验中心,江苏 泰兴 225400
2.徐州矿务集团第二医院呼吸科,江苏 徐州 221011
3.徐州矿务集团第二医院检验中心,江苏 徐州 221011

作者简介:朱继文,男,1975年生,学士,副主任技师,主要从事分子生物学检验工作。

摘要
目的

设计茎环结构引物,建立外周血检测微小RNA-21(miR-21)的检测方法,并初步应用于支气管哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)样本的检测。

方法

设计miR-21的茎环结构反转录引物和聚合酶链反应(PCR)扩增引物,以U6为内参照,利用SYBR green实时荧光PCR检测20例支气管哮喘患者和20名健康人的外周血miR-21的表达水平,并分析2组间的差异。

结果

SYBR green实时荧光PCR检测U6和miR-21含量的熔解曲线单一,PCR产物特异。在外周血中20例哮喘患者的miR-21水平明显高于20名健康人( P<0.001)。

结论

本实验成功建立了SYBR green荧光定量PCR检测外周血miR-21表达水平的技术平台,为miR-21在支气管哮喘发生中分子生物学机制研究建立了基础。

关键词: 微小RNA-21; SYBR green实时荧光定量; 支气管哮喘
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)12-1043-04
Establishment of a method for peripheral blood miR-21 detection and its primary application in bronchial asthma determination
ZHU Jiwen1, ZHANG Daoji2, YAN Hong3, HAN Junling2
1. Center of Clinical Laboratory,the Second Hospital of Taixing, Jiangsu Taixing 225400,China
2. Department of Respiratory, the Second Hospital of Xuzhou Coal Clique, Jiangsu Xuzhou 221011,China
3. Center of Clinical Laboratory, the Second Hospital of Xuzhou Coal Clique, Jiangsu Xuzhou 221011, China
Abstract
Objective

To establish a stem-loop method for peripheral blood microRNA-21(miR-21) detection in peripheral blood monocytes(PBMC),and primarily apply the method into bronchial asthma patients.

Methods

According to the sequence of miR-21,the stem-loop reverse transcription primer and the primer of polymerase chain reaction (PCR) were designed and synthesized. The expression levels of miR-21 in PBMC of 20 bronchial asthma patients and 20 healthy subjects were measured by SYBR green real-time fluorescence PCR with U6 as control. The difference between the 2 groups was analyzed.

Results

The melting curve of U6 and miR-21 in the 2 groups showed a single peak by SYBR green real-time fluorescence PCR,and the product of PCR was specific. The miR-21 levels in PBMC of 20 bronchial asthma patients were significantly higher than those of 20 healthy subjects ( P<0.001).

Conclusions

The method of detecting miR-21 expression levels by SYBR green real-time fluorescence quantitative PCR is established successfully in PBMC. Moreover,it provides the basic reference for molecular-biology research of miR-21 in bronchial asthma.

Keyword: MicroRNA-21; SYBR green real-time fluorescence quantitation; Bronchial asthma

微小RNA(microRNA, miRNA)是在动物、植物和病毒中发现的一个非编码单链小RNA, 由21~24个核苷酸组成。越来越多的研究表明, miRNA参与生命过程中的一系列重大进程, 包括胚胎早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、炎症免疫和脂肪代谢等。miRNA-21(miR-21)是近年来备受关注的miRNA之一, 其在肿瘤[1]、神经系统疾病、心血管系统疾病[2]和内分泌系统疾病中都有不少报道, 但在呼吸系统疾病中报道甚少。

目前常用的检测miRNA方法有Taqman探针法、Northern blot和原位杂交等方法。Northern blot和原位杂交2种方法能够半定量地表示miRNA的丰度和定位显示miRNA, 但检测时间较长。Taqman探针法是目前最常用的检测miRNA的工具, 具有特异性高、花费时间短等优点, 但成本较高。本实验以较廉价的SYBR green染料代替Taqman探针, 建立利用SYBR green实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测外周血中miR-21表达丰度的技术平台[3], 并对人类常见的呼吸道疾病— — 支气管哮喘做初步研究。

材料和方法
一、材料

1.研究对象

健康人外周血来自体检正常者, 共计20份, 每份采集5 mL, 采用浓度为0.04 mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝, 每5毫升的血液中加入0.4 mL EDTA。支气管哮喘患者来自徐州矿务集团第二医院, 按照不同病程采集标本, 每份5 mL, EDTA抗凝, 每5毫升的血液中加入0.4 mL EDTA, 共检测支气管哮喘患者20例。

2.主要试剂和仪器

Trizol(美国Invitrogen公司); 反转录PCR试剂盒 (PrimeScriptTM one step RT-PCR kit)购自Toyobo公司; SYBR green Taq试剂盒购自中国TaKaRa公司; 荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司); 分光光度仪(德国EPPENDORF公司)。

3.引物设计和合成

依据miR BASE(http://microrna.Sanger.ac.uk/sequences)数据库人U6和miR-21的序列, 根据相关文献报道首先设计茎环结构(stem-loop)的逆转录引物[4], 其中包含有44 bp的茎环结构和3' 端的6个miR-21碱基序列, 然后按照逆转录产物的序列自行设计PCR引物。miR-21逆转录引物序列为5'-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-ATACGACTCAACA-3'; PCR扩增引物上游为5'-GTTAGCTTATCAGACTGA-3', 下游为5'- GTGC-AGGGTCCGAGGTAT-3'。采用U6snRNA作为内参, 其逆转录引物序列为5'-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3', PCR扩增引物上游为5'-CTCGC-TTCGGCAGCACA-3', 下游为5'-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3'。所合成的miR-21长度为66 bp, U6长度为94 bp。本研究所有引物由上海生物工程公司合成。

二、方法
1. 外周血单个核细胞(PBMC)的分离及提取总RNA

取健康体检者和支气管哮喘患者新鲜外周血(EDTA抗凝)5 mL, 适当稀释后再经比重1.077 的Ficoll分离PBMC, 放入另一试管中, 并加10 mL磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次, 然后采用Trizol提取总RNA, 操作按照说明书进行, EPPENDORF分光光度仪检测RNA质量和浓度。

2. 逆转录PCR

取1 μ g总RNA, 分别以miR-21和U6逆转录引物进行逆转录反应, 反应条件为16 ℃孵育15 min, 42 ℃反应1 h, 85 ℃孵育5 min, 得到的cDNA置于-20 ℃保存。分别以miR-2l 和U6 cDNA为模板, 以miR-21和U6的特异性引物, 以20 μ L体系进行PCR。PCR的反应条件是:95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。取PCR产物10 μ L在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 并染色拍照。

3. 实时荧光PCR

反应参数为95 ℃ 10 min预变性, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 荧光检测1次, 共40个循环。在65~95 ℃间, 以0.5 ℃/s为间隔绘制熔解曲线, 记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值, 反应结束后根据熔解曲线分析产物特异性。每组设3个复孔, 以U6作为内参照。采用定量PCR中的相对定量法, 以2-△ △ Ct表示支气管哮喘患者目的基因的表达相对于配对的正常组群的变化倍数, 其中△ △ Ct=(CtmiR-21-CtU6)患者组-(CtmiR-2l-CtU6)正常组。

三、统计学方法

检测数据用 x̅± s表示, 2组间比较应用SPSS 13.0 软件进行t检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、miR-21和U6扩增结果

10%聚丙烯酰胺凝胶电泳显示, miR-21和U6 逆转录PCR产物片段大小分别为66和 94 bp。见图1。

图1 miR-21和U6扩增结果

二、实时荧光PCR扩增曲线和熔解曲线分析

哮喘患者和健康者U6的Ct值为20.00± 1.83, 哮喘患者的miR-21 Ct值为24.20± 0.56, 健康者的miR-21 Ct值为34.40± 0.38。见图2a。熔解曲线图表明, U6和miR-21的熔解曲线单一峰值有差异。miR-21和U6均未见杂峰信号出现, miR- 21溶解温度为82.5 ℃; U6溶解温度为78.5 ℃。说明二者的PCR参数选择适当, 产物特异性较好, 非特异产物对结果影响较小。见图2b。

图2 实时荧光PCR扩增曲线和熔解曲线

三、miR-21在2组人群中的表达变化

采用配对样本的Wilcoxon符号秩检验, miR-21在哮喘患者组和健康对照组中的表达变化差异有统计学意义(P< 0.001)。见图3。

图3 miR-21在2组人群中的表达变化

讨论

在临床实践中, 外周血的检测具有创伤小、可重复、可于同一时间点进行检测多项指标等优点, 是疾病诊断和随访的理想手段。国内外研究表明, 外周血miRNA稳定性强, 能够反映生理状态的异常, 而且外周血miRNA的表达不存在明显的性别差异, 也不存在显著的个体差异[5], 因此有望作为临床检测的标本来源。

miRNA的检测方法有很多种[6], 最经典的方法是Northern blot, 但由于操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高, 在实际工作中难以推广应用。目前对miRNA的定量检测主要借助于实时荧光定量PCR技术, 有Taqman探针法和SYBR green法, 前者特异性高, 但操作复杂、价格昂贵, 在临床普及有一定难度。SYBR green法操作简单、成本低廉, 但特异性较差。2005年Chen's等报道的茎环逆转录PCR新技术在特异性和敏感性方面相对于原有的SYBR green法有了明显的提高。同时, 茎环结构的逆转录引物在逆转录后增加了cDNA的长度, 克服了miRNA长度短小而难于检测的困难。曾报道运用茎环结构的引物, 类风湿性关节炎患者外周血中检测到miR-34a的表达 [7]。本实验用融点曲线分析显示设计的引物能够特异性扩增出miR-21和U6基因。为今后研究外周血中miRNA的表达建立了一种强有力的技术平台。

支气管哮喘是人类常见的呼吸道疾病, 是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾患, 发生的分子生物学机制复杂。临床上也很少从分子生物学方面精确、敏感地诊断和用于疗效的客观判断。Mattes等[8]曾报道在哮喘病中miR-126抑制Th2细胞的效应功能而促进疾病发生。本研究初步显示miR-21在支气管哮喘患者的外周血中相对于健康者表达明显升高(P< 0.001), 这为哮喘患者的诊断和治疗提供了一个基础。但是对具体的哮喘病的发作期和缓解期有否差异以及miR-21可否作为分子生物学诊断的一个指标, 进而可以运用miR-21的反义寡核苷酸或抑制剂治疗该疾病, 还有待于进一步探索。

本研究建立的在外周血中用实时PCR检测miR-21的方法是一种快速、有效、敏感性高和特异性好的检测方法, 利于在临床推广应用, 有助于对哮喘病发生、发展的分子生物学机制的深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Pan Q, Luo X, Chegini N. MicroRNA 21: response to hormonal therapies and regulatory function in leiomyoma, transformed leiomyoma and leiomyo-sarcoma cells[J]. Mol Hum Reprod, 2010, 16(3): 215-227. [本文引用:1]
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[3] Vaz C, Ahmad HM, Sharma P, et al. Analysis of microRNA transcriptome by deep sequencing of small RNA libraries of peripheral blood[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 288. [本文引用:1]
[4] Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33(20): e179. [本文引用:1]
[5] Hunter MP, Ismail N, Zhang XL, et al. Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles[J]. PLoS ONE, 2008, 3(11): e3694. [本文引用:1]
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[7] 陈晓旦, 刘秀雯, 吴琳, 等. MicroRNA-34a 检测方法的建立及其在类风湿性关节炎中的应用[J] . 现代检验医学杂志, 2010, 25(1): 22-24. [本文引用:1]
[8] Mattes J, Collison A, Plank M, et al. Antagonism of microRNA-126 suppresses the effector function of TH2 cells and the development of allergic airways disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(44): 18704-18709. [本文引用:1]