引用本文
乔昀, 陈君灏, 罗云桃, 赵英妹, 张珏. 医院感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因分型研究. 2012, 27(11): 1031-1034
QIAO Yun, CHEN Junhao, LUO Yuntao, ZHAO Yingmei, ZHANG Jue. Genotyping research of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in nosocomial infection . Labratory Medicine, 2012, 27(11): 1031-1034  
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医院感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因分型研究
乔昀, 陈君灏, 罗云桃, 赵英妹, 张珏
上海中医药大学附属曙光医院检验科,上海 200021

作者简介:乔昀,女,1971年生,学士,副主任技师,主要从事微生物学检验工作。

通讯作者:张珏,联系电话: 021-53827187。

摘要
目的

分析医院不同科室来源的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株基因分型同源性,为控制MRSA医院感染流行提供科学依据。

方法

使用细菌基因组重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)以及高级微生物基因分型系统(DiversiLab)细菌同源性分析技术对23株医院感染的MRSA进行基因分型。

结果

23株MRSA分为4个基因型,A型、D型主要分布于急诊观察室,B型、C型主要分布于中医外科。

结论

中医外科存在以B型、C型基因型为流行株的MRSA医院感染爆发;REP-PCR技术和DiversiLab自动化细菌同源性分型技术可成为医院感染病原研究的有效手段。

关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 医院感染; 基因分型
中图分类号:R378.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)12-1031-04
Genotyping research of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in nosocomial infection
QIAO Yun, CHEN Junhao, LUO Yuntao, ZHAO Yingmei, ZHANG Jue
Department of Clinical Laboratory,Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200021,China
Abstract
Objective

To provide scientific reference for controlling hospital acquired infection through analyzing the genotype homology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) which were isolated from different departments of hospital.

Methods

The genotypes of 23 strains of hospital acquired MRSA were analyzed by repetitive polymerase chain reaction (REP-PCR) and DiversiLab genotype system.

Results

Hospital acquired MRSA were classified into 4 kinds of genotypes(A,B,C and D).A and D types were mainly distributed in Emergency Observation Room, while B and C types were mainly distributed in Traditional Chinese Medicine Surgery Department.

Conclusions

B and C types may cause infection outbreak in Traditional Chinese Medicine Surgery Department as epidemic strains. REP-PCR and DiversiLab genotype system can be efficient ways for research of pathogen on nosocomial infection.

Keyword: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Nosocomial infection; Genotyping

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococus aureus, MRSA)是医院感染的主要致病菌之一, 1961年便在英国发现了世界首例MRSA。目前在许多国家MRSA的感染率仍在上升。由于MRSA具有传播途径广、致病性强的特点, 加上抗菌药物的长期使用和滥用, MRSA的耐药范围日益扩大, 耐药程度日益严重, 给临床治疗带来巨大的困难, 也有人将其称为“ 超级细菌” 。为了解医院不同科室来源的MRSA菌株基因的同源性, 本研究对2011年2至6月医院临床分离的23株MRSA菌株应用Agilent2100分析仪的高级微生物基因分型系统(DiversiLab)对其结果进行分析, 以追踪传染源和可能的传播途径, 为采取有效措施预防和控制医院感染的发生提供科学依据。

材料和方法
一、材料

1.标本来源

收集2011年2至6月上海中医药大学附属曙光医院重症监护室(ICU)、急诊观察室、中医外科入院48 h后患者送检的各类临床标本(标本送检离入院时间> 48 h为医院感染), 剔除重复菌株后共分离到23株MRSA, 其中急诊观察室6株, 中医外科13株, ICU 4株。标本类型包括脓液12株、痰4株、尿2株、分泌物2株、咽拭子2株、血液1株。

2.仪器和试剂

法国生物梅里埃公司的VITEK 2 Compact 微生物鉴定药敏分析系统、Agilent2100分析仪、自动化DiversiLab 微生物DNA指纹图谱分析系统及其UltraCleanTM微生物DNA分离试剂盒、DiversiLab DNA指纹图谱试剂盒、芯片试剂盒。血平板由上海伊华生物技术有限公司生产。

3.标准菌株

金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)由上海市临床检验中心提供。

二、方法

1.细菌鉴定

标本送实验室后及时接种于血琼脂培养基上, 经35 ℃培养24 h。金黄色葡萄球菌用法国生物梅里埃公司的VITEK 2 Compact 仪VITEK GP板条进行鉴定。按美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准[1]操作, 将0.5麦氏单位金黄色葡萄球菌的新鲜菌悬液均匀涂布于水解酪蛋白胨(MH)平板, 贴上头孢西丁(30 μ g)纸片, 35 ℃有氧环境孵育24 h观察结果, 测量抑菌圈直径。金黄色葡萄球菌抑菌圈直径≤ 19 mm为耐药, 即MRSA。

2.基因组重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)操作程序

按照DiversiLab自动化分型系统要求操作, 细菌在琼脂平皿上培养过夜, 用10 μ L接种环取细菌1环 , 用DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。DNA浓度使用分光光度计定量, 模板浓度要求在25~50 ng/μ L 之间。提取的DNA置-20 ℃备用。REP-PCR 体系为25 μ L, 其中重复序列PCR MM1 18 μ L, 引物混合物 2 μ L, 10× PCR 缓冲液和AmpliTaq DNA 聚合酶分别为2.5和0.5 μ L, 基因组DNA模板2 μ L。REP-PCR参数为:预变性94 ℃ 2 min; 变性94 ℃ 30 s; 退火45 ℃ 30 s; 延伸70 ℃ 90 s, 共35个循环, 最后延伸70 ℃ 3 min。将PCR 产物加载到微流芯片, 通过Agilent生物分析仪进行电泳, 探测产物的荧光强度, 绘制电泳片段峰式坐标图和模拟的胶样指纹图。用DiversiLab分析软件对结果进行阅读和分析。树状图在树状结构上显示指纹图谱相似度, 从而帮助可视化显示标本的分类情况。相似度矩阵提供了报告中每对标本间的相似度百分比, 阐明树状图中所见的平均化结果。

3.同源性判断标准

计算标本间相似度方法采用Pearson 相关系数(PC), 这种方法强调峰强超过峰的存在情况, 当图谱之间差异显著, 而在高强度峰的数量及位置方面尤其明显时, 则选择 PC 选项。根据MRSA遗传学高度相似性的特征, 将聚类结果的Cut off值选择在95%。菌株间相似性> 97%且胶样图无条带差别的菌株认定为相同; 相似性> 95%, 有1条条带不同判定为相似; 相似性< 95%, 有2 条及2条以上条带不同就认定为不同菌株[2, 3, 4]。按照DiversiLab自动化分型系统操作要求, 胶样图有疑问的菌株应追溯该菌的峰式坐标图, 此坐标图的比较结果是菌株间同源性的最终结果。

结果
一、MRSA菌株基因分型与来源

23株MRSA分别分离自ICU 、急诊观察室和中医外科。编号为SG 1、2、7、14菌株分离自ICU(共4株), SG3~6、SG9~10、SG16、SG18~23菌株分离自中医外科(共13株), SG8、SG11~13、SG15、SG17菌株分离自急诊观察室(共6株)。DiversiLab分型系统将本次研究的23株MRSA分为4型。A型菌株为SG12、13、14、8, 主要分布于急诊观察室; B型菌株为SG1、5、7、16、19、22、23, 主要分布于中医外科; C型菌株为SG3、4、6、10、18、20、21, 全部分布于中医外科; D型菌株为SG2、15、17, 主要分布于急诊观察室。见图1。

图1 DiversiLab 同源性分析树状图

二、同源性分析

采用REP-PCR对遍布于细菌基因组中的非编码重复序列进行扩增, 从而产生各种片段大小不同的扩增产物, 扩增的片段在DNA芯片装置下由微流体分开, 荧光吸收检测后DiversiLab系统收集并分析数据, 同时产生相应的峰值图, 不同峰值代表不同大小DNA片段, 峰的位置、数目、峰高等特征判断菌株的同源性, 如果峰的位置、数目和峰高都一致, 两者的电泳图形可以重叠, 则认为是同一克隆, 划分为同一组; 有1条条带不同或峰的位置不同, 则认为2株菌相似。本次研究中DiversiLab 分析软件的分析结果做同源性树状图, 见图1。根据树状图菌株间相似性> 95%可判断菌株是相同或相似, 可将23株MRSA分为4种基因型。相似度高(> 97%)可认为来源于同一克隆[2, 3, 4]。菌株间相似度的百分比见图2。如SG8和SG13的相似度为97.3%。

图2 23株菌株相似度矩阵图

讨论

医院感染MRSA几乎都是通过身体接触传播的, 多发生于具有严重基础疾病、年老体弱、静脉药物依赖、经常使用抗菌药物等高危因素的住院患者。MRSA引起的感染在全球范围内具有很高的发病率和病死率。近年来, MRSA的感染率和耐药率逐渐上升, 且很容易通过交叉感染在医院内爆发流行, 给临床抗感染治疗带来挑战。本研究应用DiversiLab自动化REP-PCR分型系统对2011年2至6月医院感染的MRSA进行分子流行病学分型研究, 分析其在医院的分布情况及可能的传播途径。

曙光医院23株MRSA分为4种基因型, 同一科室分离的菌株间有一定的同源性。中医外科13株中主要有2种基因型, B型5株、C型7株、1株散在, 急诊观察室6株中主要是A型3株、D型2株、1株散在; ICU 4株MRSA有3种基因型, A型1株、B型2株、C型1株, 说明流行株有病区差异。本研究中中医外科5株B型的MRSA全发生在入院后2个月(5~6月份)内, 7株C型的MRSA全发生在入院后3个月(3~5月份)内。在医院感染病例流行强度监测中, 由单一菌株在3 个月内同一病区引起≥ 3例MRSA医院感染定义为爆发[5] 。可见中医外科存在以B型、C型基因型为流行株的MRSA医院感染爆发。急诊观察室6株MRSA有2种基因型但发生的时间超过3个月, 不属于医院感染爆发。ICU有各科转至的危重患者, 4株MRSA有3种基因型, 包括了中医外科流行的B型、C型以及急诊观察室流行的A型。在急诊观察室获得MRSA感染的患者, 因病情严重转入ICU 后引起ICU 的继发病例, 后者病情好转后转入普通病房, 再引起普通病房的继发病例, 这就造成科室间MRSA的传播。已经明确MRSA的医院感染主要经接触传播, 医护人员及患者的手和鼻咽是重要的传播中介, 加强洗手和隔离等卫生预防学措施可以有效地降低MRSA的感染率[6]。

目前应用于MRSA 分子分型研究的技术主要有多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 、脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、葡萄球菌蛋白A基因分型(Staphylococcal protein A gene typing, SPA typing)和REP-PCR[7, 8]等。其中, PFGE分型技术被称为细菌分子分型的“ 金标准” 。但PFGE技术步骤复杂, 对人员和设备要求较高, 操作时间长, 不适宜作为临床实验室广泛采用的研究手段。REP-PCR 分型技术原理清晰, 重复性好, 但因手工操作非常耗时、成本贵等原因而未能广泛开展[9]。DiversiLab 是基于染色体REP-PCR的同源性分析方法, 是近年来继质粒谱分析、脉冲场电泳、探针杂交等分子生物学分型方法之后发展起来的又一基因分型技术。DiversiLab 分析系统是一种标准化和自动化系统, 其结果收集和分析处理不受主观限制, 60 min就可以分析13份标本, 其通过计算机系统对微生物DNA指纹图谱比对、分析, 进行微生物的基因分型及鉴定, 具有很高的分辨率。其结果既可以以凝胶图谱输出, 也可以以荧光强度为纵坐标、相对分子质量大小为横坐标的坐标图形式输出, 输出结果量化, 不同批次和时段输出也可进行比较。树状图在树状结构上显示指纹图谱相似度, 从而帮助可视化显示标本的分类情况。相似度矩阵提供了报告中每对标本间的相似度百分比, 阐明树状图中所见的平均化结果。与传统PFGE 相比, 具有很好的相关性, 且其具有快速、易于操作、高重复性、高分辨率、结果的定量处理和多种形式输出等优点, 可以作为分型鉴定的一线工具, 尤其对短期内爆发流行时大量标本检测具有更大优势, 同时作为各医院常规鉴定和分型研究也具有很好的意义[10]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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