引用本文
江岑, 董丹凤, 俞焙秦, 彭奕冰. 重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较. 2012, 27(11): 917-920
JIANG Cen, DONG Danfeng, YU Beiqin, PENG Yibing. Comparative study on genotyping of Candida tropicalis by repetitive sequence-based PCR and multilocus sequence typing . Labratory Medicine, 2012, 27(11): 917-920  
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重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较
江岑, 董丹凤, 俞焙秦, 彭奕冰
上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025

作者简介:江岑,女,1987年生,主要从事真菌耐药机制的研究。

通讯作者:彭奕冰,联系电话:021-64370045。

摘要
目的

分析比较重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)与多位点分型技术(MLST)在热带假丝酵母菌基因分型中的应用。

方法

收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌,分别以Ca-21、Ca-22、Com-21两两组合为引物,选用最合适的引物对进行 REP-PCR后通过电泳获得REP-PCR型。在不同型别中各挑选3株采用MLST法扩增热带假丝酵母菌的6个管家基因,扩增片段测序后与数据库比对得到相应的序列型(sequence type,ST)。

结果

REP-PCR以Com21-Com21为引物对分型效果最好,REP-PCR与MLST分型结果一致。147株热带假丝酵母菌产生A~H共 8种REP-PCR型,分别对应MLST的ST146、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和ST117。

结论

REP-PCR与MLST在热带假丝酵母菌的基因分型中分辨率相同,而REP-PCR更为方便迅速,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。

关键词: 热带假丝酵母菌; REP-PCR; MLST; 基因分型
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)11-0917-04
Comparative study on genotyping of Candida tropicalis by repetitive sequence-based PCR and multilocus sequence typing
JIANG Cen, DONG Danfeng, YU Beiqin, PENG Yibing
Department of Clinical Laboratory,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To compare repetitive sequence-based polymerase chain reaction (REP-PCR)and multilocus sequence typing (MLST)in genotyping of Candida tropicalis.

Methods

REP-PCR was performed on 147 clinical isolates of Candida tropicalis collected from 6 hospitals of 5 provinces.Primer Ca-21,Ca-22 and Com-21 were used pairly to find the most suitable pair.Three isolates of Candida tropicalis from different REP-PCR types were tested by MLST.Six loci in housekeeping genes were sequenced after amplification,which were compared with the MLST database to obtain sequence type (ST).

Results

Eight REP-PCR types were found in 147 isolates of Candida tropicalis with primer Com21-Com21,which had the best genotyping effect.Type A-H were corresponding with ST146,NEW1,ST136,ST127,ST177,ST169,NEW2 and ST117 by MLST respectively.

Conclusions

REP-PCR offers a simple and rapid method for molecular typing,which has a similar discriminatory power with MLST.Therefore,REP-PCR can be the first choice in laboratory,especially for a large number of isolates.

Keyword: Candida tropicalis; Repetitive sequence-based polymerase chain reaction; Multilocus sequence typing; Genotyping

假丝酵母菌是临床真菌感染的主要致病菌, 虽然目前临床分离率最高的酵母菌仍是白假丝酵母菌, 但由非白假丝酵母菌类真菌引起的发病率和死亡率近年来显著升高。Pfaller等[1]发现在1997~2003年期间白假丝酵母菌的分离率呈下降趋势, 而热带假丝酵母菌的临床分离率从4.6%上升到7.5%。热带假丝酵母菌多发于器官或骨髓移植、恶性血液病、癌症及糖尿病患者[2, 3]。

基因分型技术是热带假丝酵母菌感染状况、耐药机制研究尤其是流行病学调查的重要工具。目前, 常用的分子生物学分型方法包括随机扩增片段长度多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD), 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE), 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphis, RFLP), 重复序列聚合酶链反应(REP-PCR), 多位点序列分析(multilocus sequence typing, MLST)等。每种方法均各有利弊, 其中MLST技术是目前公认的最为权威客观的分型方法[4, 5, 6]。

REP-PCR主要通过扩增基因组中的重复序列和电泳条带分析, 揭示基因组间的差异, 是一种基因组指纹分析方法。而MLST则是通过扩增数个管家基因并测序后, 与数据库进行对比得到每个管家基因的等位基因号, 再根据所有等位基因号的组合得到每株菌的序列型(sequence type, ST)。本实验通过REP-PCR对147株热带假丝酵母菌分型后, 又采用MLST技术对不同型别进行验证, 证实了2种分型方法在热带假丝酵母菌的基因分型中具有相同的分辨效率, 为选择更为便捷有效的分型方法提供了理论依据。

材料和方法
一、材料
1. 菌株来源

分别收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌, 其中上海瑞金医院43株、上海华山医院47株、安徽省立医院12株、南京鼓楼医院32株、深圳人民医院12株以及河南平顶山第四人民医院1株。

2. 仪器与试剂

API微生物鉴定系统(法国梅里埃公司); PCR扩增仪(PTC-100 Thermal Cycle, 美国MJ Research公司); REP-PCR及MLST所用引物均由Invitrogen上海技术服务部合成; PCR反应试剂盒购自日本Takara公司; Lyticase细胞溶菌酶购自美国Sigma公司; 电泳成像系统为Tanon 4100成像系统。

二、方法
1. 菌株鉴定

标本接种于科玛嘉显色平板35 ℃培养48 h后, 热带假丝酵母菌为深蓝绿色菌落。经API 20C AUX酵母菌鉴定板条进一步鉴定后, 置于20%甘油培养液中, -80 ℃冻存。

2. DNA提取

参照Redkar RJ等[7]文献记载的方法提取DNA, 保存于-20 ℃。

3. REP-PCR分型检测

根据Redkar RJ等[7]的报道设计引物:Ca-21(5'-CATCTGTGGTG-GAAAGTAAAC-3'), Ca-22(5'-ATAATGCTCAAA-GGTGGTAAG-3'), Com-21(5'-GCCGTTTTGGCC-ATAGTTAAG-3')。25 μ L PCR反应体系包括10× E× Taq缓冲液(含Mg2+)2.5 μ L, 2.5 mmol/L dNTPs 2μ L, 10 μ mol/L引物各1 μ L, TaKaRa E× Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L, DNA(50 ng/μ L)1 μ L。分别将3个引物两两组合或自身组合进行PCR反应, 选取最合适的引物对。扩增程序:94 ℃ 2 min; 92 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 70 ℃ 90 s, 共35个循环; 70 ℃ 3 min。PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳, Tanon 4100 成像系统摄影。

4. MLST分型检测

通过查阅热带假丝酵母菌MLST数据库 (http://pubmlst.org/ctropicalis/), 并参考Arianna T等[8]的报道, 分别用6对引物扩增热带假丝酵母菌ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a等6个管家基因片段, 引物序列见表1。 50 μ L PCR反应体系包括5× Prime STAR缓冲液(含Mg2+)10 μ L, 2.5 mmol/L dNTPs 4 μ L, 10 μ mol/L引物各1 μ L, PrimeSTAR DNA聚合酶(2.5 U/μ L)0.5 μ L, DNA(200 ng/μ L)1 μ L。扩增程序:94 ℃ 7 min; 94 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 74 ℃ 1 min 5 s, 共30个循环; 74 ℃ 10 min。扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳证实为单一条带后, 送Invitrogen公司测序, 测序引物与扩增引物相同。使用SciED7软件将所测序列与热带假丝酵母菌MLST数据库进行比对。

表1 MLST所用扩增及测序引物
5. 数据分析

用MEGA5.0分析软件UPGMA统计学方法对147株热带假丝酵母菌进行同源性分型, 建立进化树图, 研究热带假丝酵母菌菌株之间的相关性。

结果
一、REP-PCR分型结果

引物Ca21-Ca22、Ca21-Com21、Ca22-Com21、Ca21-Ca21及Ca22-Ca22扩增出的条带数目较少或条带模糊不易分辨, 而以Com21-Com21为引物扩增的条带较多且最为清晰, 故选用此对引物进行REP-PCR分型。根据PCR产物电泳图谱, 147株热带假丝酵母菌分为A~H 共8个型别, 见图1。其中A型9株(6.1%), B型7株(4.8%), C型56株(38.1%), D型23株(15.6%), E型22株(15.0%), F型20株(13.6%), G型4株(2.7%), H型6株(4.1%)。由于河南来源的菌株过少, 故只统计分析了其余4个地区菌株型别的组成, 见图2。上海地区90株热带假丝酵母菌的型别最多, 其中C型所占比重最大(36株/90, 40%), 而B型和H型只在上海地区有出现。

图1 热带假丝酵母菌REP-PCR产物电泳图（注:1~8泳道分别为A~H型条带; 第9泳道为阴性对照; marker为100bp DNA Ladder marker）

二、MLST分型结果

分别挑选不同REP-PCR型别的热带假丝酵母菌各3株进行MLST分型, 对应得到8种不同的ST型, 其中2种为新型, 见表2。同时, 同一种REP-PCR型别的热带假丝酵母菌MLST型别也相同。8种热带假丝酵母菌的MLST序列用MEGA5.0分析软件使用UPGMA统计方法建立进化树, 见图3。以序列相关性≥ 95%分组, 不同ST型间的同源性均< 95%, 属于不同的克隆来源, 故每一型为一组。

图2 除河南外各地区热带假丝酵母菌REP-PCR型别的组成（注:上海90株, 深圳12株, 南京32株, 安徽12株, 共146株）

图3 8种热带假丝酵母菌MLST型别的同源性树状图

三、REP-PCR分型与MLST技术的比较
表2 不同REP-PCR型别的热带假丝酵母菌MLST分型结果
讨论

REP-PCR是Versalovic于1996年提出的一种基因组指纹分析方法, 被广泛应用于细菌和真菌的基因分型[7]。常用于真菌REP-PCR的引物主要有Ca-21、Ca-22和Com-21, 主要来源于白假丝酵母菌的两端重复序列Care-2和Com29[7]。已有文献报道中多采用Ca-21-Ca-22为引物对热带假丝酵母菌进行REP-PCR, 而本实验中采用Ca21-Ca22引物对得到的电泳条带很少, 不适合分型。以Com21-Com21为引物扩增的条带较多且最为清晰, 故选用此对引物进行REP-PCR分型。这也表明热带假丝酵母菌REP-PCR引物的组合并非绝对, 可根据各实验室的实际情况选择最合适的引物对, 这种差异可能是由不同菌株来源以及实验条件造成的。本实验对来自5个地区的6家医院共147株热带假丝酵母菌进行REP-PCR分型后, 得到A~H共8种REP-PCR型, 其中C型所占比重最大56株(38.1%)。上海地区热带假丝酵母型别最多, 并且B型和H型只在上海地区有出现, 这可能是由于瑞金医院和华山医院作为全国性综合医院收治了各地的患者, 导致了菌株的多样性。

MLST是选择位于6个管家基因内的片段进行扩增和序列分析, 分型结果更为客观。在之前的研究中我们已发现MLST与REP-PCR具有相同的分辨率[9], 因此, 在本实验中只挑选了每种REP-PCR型别各3株进行MLST验证。结果共发现8种相对应的ST型, 其中2种为新型, 与REP-PCR结果一致。同时, 同一种REP-PCR型别的3株热带假丝酵母菌的MLST型别也相同。现有的热带假丝酵母菌ST型已有202种, 远远多于白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌。我们所发现的型别全部位于ST100之后, 表明临床上新型热带假丝酵母菌出现的频率非常快, 这可能也导致了近几十年来热带假丝酵母菌临床分离率的上升。

综上所述, MLST的分型结果更为客观, 各实验室之间的可比性强, 适用于全球流行病学的调查研究, 但耗时较长, 成本较高。而REP-PCR只需选择合适的引物, 扩增后进行电泳条带比对即可分析, 相对于MLST更为方便快捷, 可作为实验室大量菌株分型的首选方法。近年来, 基于REP-PCR原理的DiversiLab自动化分型系统也被逐渐应用[10], 其采用标准化的操作, 应用微流体芯片分离和荧光检测系统及统一的数据处理软件, 简化操作步骤, 使REP-PCR分型结果更精确、重复性更高。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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