目前常用的结核分枝杆菌实验室检测方法有病原学检测(痰涂片镜检、分离培养)、免疫学检测(酶联免疫吸附试验、免疫胶体金标记技术)、分子生物学技术(聚合酶链反应、核酸探针技术、DNA芯片技术)等。

痰液涂片经抗酸染色后镜检是发现开放性肺结核病最经典、最有效的手段。抗酸染色是利用结核分枝杆菌细胞壁含有的霉菌素具有被抗酸染料染色的特点, 镜下可见成团、成簇或单个存在的红色杆菌。但结核分枝杆菌不是具有此特性的惟一细菌, 放线菌和红线菌都具有部分抗酸染色特性, 因此, 抗酸染色阳性只是一种结核感染推测性证据, 不是绝对性的。阳性结果说明抗酸杆菌存在, 而不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌, 但实际上假阳性极低。标本经抗酸染色后镜检结核分枝杆菌的敏感性较低, 标本中至少含有10 000个细菌/mL, 抗酸染色镜检才能呈阳性, 所以其敏感性受到一定限制。此外, 标本保存时间是否过长、标本质量好坏、是否停服抗结核药等都可直接影响到镜检的结果。由于直接痰涂片镜检结核分枝杆菌平均检出率只有25 %~35 %, 因此, 即使涂片阴性也不能排除结核病, 且镜检中无法区分死菌、活菌, 易受到外源性污染的影响^[1]。

结核分枝杆菌培养是目前结核分枝杆菌确诊的金标准。每毫升含10~100个结核分枝杆菌活菌的浓缩物培养可获阳性结果。培养法周期较长, 约需4~8 周, 不利于肺结核病及时诊断和治疗。此外, 为获得培养浓缩物, 痰标本培养前通常需要经过液化过程, 但消化液(4%NaOH溶液)会杀死一部分结核分枝杆菌, 将会影响到结核分枝杆菌培养的结果。

近年来, 国内外研究者在改进传统细菌学检验方法的基础上, 在免疫学、分子生物学以及分子微生物学领域建立了很多快速、敏感、特异、简便的实验诊断新方法。

免疫学方法是近年来国内外广泛用于临床结核病快速诊断的检测方法。当机体受到结核抗原的刺激后可以产生相应的抗体, 因此, 通过检测结核相应抗体可辅助临床诊断结核分枝杆菌感染^{[2, 3]}。目前, 检测结核分枝杆菌抗体的主要方法有酶联免疫吸附试验、胶体金免疫测定技术等。从临床角度看, 虽然其应用十分广泛, 但会受观察对象不同、检测使用的抗原不同、质量控制不易等因素影响, 结果差异较大。Mycodot^TM方法通过测定血清中阿拉伯甘露糖(LAM)抗原达到辅助诊断的目的, 只有当患者为活动性结核病时才有阳性反应, 而对健康人、既往感染者以及卡介苗接种者都呈阴性反应^[4] 。

聚合酶链反应和聚合酶链反应斑点杂交是以核酸扩增技术为基础的分子生物学诊断技术, 其可以检测出1~100 fg纯化分枝杆菌DNA, 相当于1~20个结核分枝杆菌/mL。这些方法具有快速、敏感、特异的优点, 适合结核分枝杆菌这类生长缓慢细菌的快速诊断^{[5, 6, 7]}。但收集标本及实验操作过程中的污染、扩增循环过多或退火温度过低等因素容易导致假阳性。

噬菌体裂解法检测结核分枝杆菌近年来也常见报道, 此方法在检测结核分枝杆菌、鉴别死活菌、特别是在结核分枝杆菌药物敏感性试验方面开辟了一个新途径, 但实际应用中可能还存在一定程度的不稳定性。

对于结核病高发的贫穷国家来说, 涂片镜检仍是最主要的诊断结核病的方法。但是很多实验室痰液标本不经过离心, 直接涂片镜检。研究结果显示, 直接涂片镜检敏感性低于经富集后的涂片镜检。在培养阳性的标本中, 采用直接涂片镜检的敏感性为31%~ 80%, 而通过富集后的痰涂片镜检敏感性可达44%~ 98% ^[8]。可见通过富集结核分枝杆菌可以大大提高镜检敏感性, 这对于主要依靠镜检来诊断结核病的实验室来说意义重大。

实验室常用的富集结核分枝杆菌的方法有稀释漂浮法和离心集菌法等。漂浮集菌涂片法虽然阳性率高于直接涂片法, 但操作过程中使用有机溶剂, 易造成实验室环境污染。

另一种常用的富集方法是离心集菌法, 此方法操作起来比漂浮集菌法简便、安全, 是现在实验室最常使用的富集方法。但富集过程需要离心, 每次离心标本的数量有限。另外为了调整痰标本的pH值, 需要加大量的缓冲液, 这样容易形成小团块, 直接影响后续镜检。

由于上述富集方法有很多不足, 近些年来不断出现新型的富集方法。Wilson等^[9]于2010年提出了“ TB珠” 的概念。TB珠是一种包含有化学聚合物的超顺磁性微粒, 是一种新型的功能材料。在一定的条件下, 这种化学聚合物能识别标本中分枝杆菌细胞壁的霉菌素并与其紧密结合, 通过外加磁场使这些结合有分枝杆菌的TB珠沉淀下来, 从而起到分离、富集的作用。TB珠室温下非常稳定, 碱性环境也不影响珠子与结核分枝杆菌的结合力, 这使得用碱性消化液稀释后的痰液不需要其他特殊处理直接用TB珠富集后进行镜检、培养和分子生物学分析等。Wilson等收集了由世界卫生组织提供的129份痰液标本, 对这129份标本分别用TB珠富集和离心富集后镜检的敏感性进行比较。实验结果显示, 在培养阳性的标本中采用离心富集方法镜检敏感性为91.8%, 而通过TB珠富集方法镜检敏感性为89.4%。可以看出, 在培养阳性的标本中经TB珠富集镜检敏感性与经离心富集镜检敏感性有良好的相关性, 均显著高于痰涂片镜检的平均检出率(25%~35%)。但值得提出的是, TB珠能与结核分枝杆菌很多亚型有很高的亲和力, 缺乏特异性, 相比较于离心富集方法没有检出率优势。

Qin等^[10]报道, 把荧光纳米颗粒连接在结核分枝杆菌抗体上, 与标本中的结核分枝杆菌发生抗原抗体反应, 通过荧光显微镜把结核分枝杆菌分辨出来。他们把收集的健康人痰标本分成2份, 一份中加入新鲜结核分枝杆菌活菌, 制成阳性临床标本, 另一份为阴性临床标本, 2份标本用已连接结核分枝杆菌抗体的荧光纳米颗粒来检测。阴性痰标本在荧光显微镜下未发现发光的细菌, 而阳性痰标本在很多视野中均可以看到明显发光的细菌, 与阴性标本比较可以推断出这种细菌为与荧光纳米颗粒相结合的结核分枝杆菌。

受到免疫荧光纳米颗粒高特异性、高敏感性特点和磁性富集方便、快捷的启发, 市场上先后出现了基于抗原、抗体间特异性结合的免疫学原理的磁性颗粒富集分离方法检测标本中的细菌及细胞等^{[11, 12, 13]}, 然而用于结核分枝杆菌检出的商品化试剂仍然不多。

免疫磁性颗粒富集的基本原理是以高均一性的磁性微球为固相支持物, 表面包被有免疫配基, 利用特异性的免疫学反应从混合溶液中分离检测靶物质^[14]。此方法具有以下优点:(1)分离速度快、效率高、可重复性好; (2)操作简单、不需要昂贵的器材; (3)不影响被分离细胞的生物学性状和功能。

目前利用免疫磁性微球富集结核分枝杆菌的方式有2种:直接法, 即用抗体包被磁性粒子, 再与标本中的抗原结合形成复合物, 在磁场中与其他物质分离。Grant等^[15]把抗副结核分枝杆菌的多克隆抗体与磁性颗粒连接, 通过外加磁场将牛奶标本中的副结核分枝杆菌沉淀下来, 沉淀物用金胺“ O” 荧光染色镜检。另一种方法则是间接法, 就是先用第2抗体包被磁珠, 使磁珠成为第2抗体的载体, 抗原与第1抗体结合后再加入带有第2抗体的磁珠, 磁珠上的第2抗体便与第1抗体结合, 形成复合物, 在磁场中该复合物得到分离。Mazurek等^[16]将此方法用于结核性脑膜炎患者脑脊液培养前处理。他们分别收集结核性脑膜炎患者接受抗结核治疗第3天和第10天时的脑脊液标本, 将其分成2份, 一份直接培养, 另一份经免疫磁性富集后, 对沉淀物进行培养。接受治疗第3天的脑脊液标本中, 经富集后的培养物第7天开始显示明显的生长趋势, 生长指数> 10, 而直接培养的脑脊液标本至第15天才开始生长。治疗第10天收集的标本中, 未经富集的标本没有结核分枝杆菌生长, 相反经富集后的标本第21天开始生长。免疫磁性颗粒富集法不仅有利于结核性脑膜炎的早期诊断还可以提高聚合酶链反应的敏感性。他们同时对磁性颗粒富集前后的临床阳性标本进行结核分枝杆菌聚合酶链反应, 富集后的标本中均可以查到结核分枝杆菌而未富集的标本不能。有报道称通过免疫磁性颗粒富集使得痰标本结核分枝杆菌聚合酶链反应阳性率从47.69%提高到68.46%^[17], 其原因是经免疫磁性颗粒富集可以大大浓缩标本所含的结核分枝杆菌的量, 有利于聚合酶链反应检测。

随着医学技术的不断进步, 检测结核分枝杆菌的试验方法不断完善。新型富集方法的出现说明了临床免疫学、医学工程学等多个领域的合作, 使得检测结核分枝杆菌的方法因其快捷、方便、高特异性及高敏感性等优势受到越来越多的关注。我们相信将有更多的新技术广泛应用于结核分枝杆菌的检测领域, 为结核病的早期诊断和治疗提供可靠的实验证据。