NGAL的蛋白空间结构是Coles等^[4]在1999年阐明的, 是一条相对分子质量为25 000、由178个氨基酸残基组成的多肽链, 属分泌型糖蛋白。其N端有310个螺旋, C端为α 螺旋, 而中间8段因氢键作用而呈反平行的β 折叠, 形成2个几乎相互垂直的β 片层, 这2个β 片层进一步构成一个复杂的β 折叠桶(β -barrel)状保守结构, 三者共同构成一条多肽链。中间8段反平行β 折叠桶为核心结构, 其链间的连接环, 除第1个环(称为Ω 环)外, 其余均为典型β 发夹结构。lipocalin蛋白家族所共有的结构特点为:β 折叠桶一端开放, 提供与配合体结合的进口; 另一端被N端的310个螺旋封闭; β 折叠桶底部内侧, 有疏水芳香族和脂肪族氨基酸残基排列, 形成疏水内部, 提供与亲脂性配体结合位点。NGAL除具有上述典型结构特征外, 还具备下列特点:(1) NGAL在β 折叠桶封闭端的β 4~β 5间有一个游离巯基(称为Cys87), 使NGAL可与一些蛋白质分子(如明胶酶B或MMP-9)形成分子间二硫键, 以此调节这些蛋白的活性或功能^[4], 为NGAL结合MMP-9前体奠定结构基础; (2)NGAL的β 折叠桶结构明显不同于其他lipocalin蛋白, 通常更大、更开放, 使配合体结合腔更浅^[5]; (3)NGAL可与脂肪酸如正已酸(n-capric acid, NCA)结合, 以化学组成成分的特殊形式填充在胞腔中^[5]; (4)NGAL可运输介导炎症反应的一些亲脂性分子, 如血小板活化因子(PAF)、白三烯B4(LTB4)和脂多糖(LPS)等^[6], 但NGAL无法运输视黄酸(retinoic acid, RA)。因NGAL是在研究MMP-9时被发现的, 所以NGAL和MMP-9的功能密切相关^[1]。在中性粒细胞的部分特殊颗粒中, NGAL通过二硫键与MMP-9结合, 形成相对分子质量为135 000的异二聚体, 以此调节MMP-9功能。MMP-9一般以前体(Pro-MMP-9)形式存在于细胞中, 分泌到细胞外时, 会切除N-端一部分序列而表现出活性。Pro-MMP-9在细胞内有4种存在方式:单体、同源二聚体、通过二硫键形成异二聚体(NGAL-Pro-MMP-9)和与金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)共同形成三元复合物(NGAL-Pro-MMP-9-TIMP-1)。

NGAL基因整体结构与人类lipocalin家族的其他成员高度相似。位于人9号染色体9q34区域, 全长5 869 bp^[3], 包括1 695 bp的5’ 端非转录区(untranscribed region)、3 696 bp的原始转录区(primery transcribed region)和178 bp的3’ 端非转录区。其中3 696 bp的原始转录区由7个外显子和6个内含子共同构成。NGAL的cDNA序列由63 bp的5’ 端非翻译区和 591 bp的编码区组成, 编码197个氨基酸残基的肽链, 该肽链由178个氨基酸残基构成成熟肽段和19个氨基酸前导序列共同构成^[2]。同源分析发现, NGAL与小鼠癌基因产物24p3同源性很高^[7], 2种基因的cDNA全序列同源性为71.3%, 编码序列同源性为74.2%, 5’ 端非转录区同源性为52.2%, 3’ 端非转录区同源性为67.8%。两者不同点在于小鼠癌基因产物24p3蛋白基因有6个外显子, 第6外显子相当于NGAL的第6、7外显子合二为一; 两者第1外显子长度不同, NGAL第3外显子有2个密码子丢失, 其他外显子大小基本一致; 相同点为外显子和内含子连接部位高度保守; 靠近剪切点的内含子区高度相似。此外, 人NGAL与大鼠之间的同源基因为α 2-微球蛋白。

NGAL是载脂蛋白家族一员, 是一个无处不在的相对分子质量为25 000的蛋白质。表达于骨髓而非外周血白细胞中^[3], 且只在中幼粒细胞及晚幼粒细胞分化阶段合成^[8]。NGAL存在于中性粒细胞中过氧化物酶阴性颗粒中。在这些颗粒中, 20%颗粒只含NGAL, 32%颗粒只含MMP-9, 余下48%颗粒同时含NGAL和MMP-9^[1]。另外, NGAL也表达于人体很多组织中, 比如子宫、前列腺、唾液腺、胃、阑尾、结肠、乳腺、肺等。这些器官或是暴露于微生物环境中, 或是具有分泌功能。惟一不表达NGAL的胃肠器官是小肠, 可能与无菌环境有关。另外, 外周淋巴结白细胞中也不表达NGAL基因。

(一)在肿瘤中的应用

恶性肿瘤细胞分泌蛋白分解酶, 降解细胞外基质, 这是肿瘤侵袭和转移的关键。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是其中最重要的一类蛋白水解酶。不仅可降解基底膜和基质, 突破细胞外基质屏障, 促进肿瘤侵袭和转移, 还能通过毛细血管内生、新血管生成等促进肿瘤生长和扩散, 与肿瘤的侵袭及转移有着异常密切的联系。

NGAL是活化中性粒细胞中释放的多功能蛋白^[9], 可结合MMP-9形成复合物, 保护MMP-9不被降解, 维持MMP-9酶活性; 同时, 还可结合转运小分子铁化合物到细胞膜, 从而激活或抑制铁应答基因^{[10, 11, 12]}。体外研究证明, NGAL能增强细胞铁吸收能力, 促进上皮细胞和间质细胞间的转化^[13]。NGAL通过自分泌方式, 负调控红细胞生成。过量NGAL可抑制红细胞前体细胞分化, 并诱导凋亡。说明NGAL与肿瘤发生、发展以及侵袭和转移都密切相关。NGAL能抑制H₂O₂导致的细胞凋亡, 推测其可能具有缓解细胞在氧化应激条件下所受的损伤^[14]。人NGAL同小鼠24p3蛋白具有高度同源性, 表明该基因就是一种潜在的致癌基因。

NGAL在肿瘤组织中呈现过表达现象, 有研究表明, 在食管癌、卵巢癌、乳腺癌、肺腺癌、结肠腺癌、胰腺癌中呈高表达状态^{[15, 16]}; 在肾细胞癌和前列腺癌中呈低表达状态; 淋巴癌和胸腺肿瘤中不表达。可见NGAL在肿瘤中的表达具有不均一性, 随组织类型不同而表达各异。

NGAL在肿瘤组织中表达调控机制, 随着研究深入, 愈加发现其复杂性和组织特异性。李恩民等^[17]于2003年成功克隆并鉴定了食管癌细胞NGAL基因5’ 端和3’ 端非翻译区, 发现在食管癌细胞中, NGAL基因-152~-60区段存在12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)反应元件。进一步研究发现, 在肺癌细胞中, 调控NGAL基因表达的核心启动子区和最小功能启动子区分别位于转录起始点上游-152~-141和-106~-79区间。在胃癌细胞中, NGAL基因启动子有TPA反应性, 其TPA反应元件主要位于基因5侧翼区-85~-79。NGAL基因的过度表达可能促进肿瘤的发生和直肠癌的进展, 检测肿瘤组织中NGAL的表达可能对大肠癌患者预后评估有用^[18]。NGAL基因在各种癌细胞中表达调控特点各不相同, 提示NGAL基因的表达调节存在细胞特异性。

白血病是一组造血干细胞及祖细胞的恶性克隆性造血系统恶性肿瘤。NGAL最初发现于人类中性粒细胞过氧化酶阴性颗粒中, 该颗粒只在中幼粒细胞和晚幼粒细胞的分化阶段合成。2001年Opdenokker等^[19]发现MMP-9是白细胞生物学功能的重要调节和效应因子, 两者提示可能与血液病发生和发展相关。2008年法、美两国的研究小组分别证明NGAL在BCR-ABL⁺的慢性粒细胞性白血病(CML)发病中有重要致病作用^{[20, 21, 22]}。2009年, 美国马萨诸塞州大学医学院Sheng等^[23]利用小鼠模型基本阐明NGAL在CML发生过程中的致病机制。

NGAL在所有血液肿瘤中表达并不一致, 表明NGAL在血液肿瘤的发生和发展过程中具有一定的特异性。目前研究表明, 在CML中NGAL呈高表达, 而在某些肿瘤如多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中表达呈明显下降趋势。目前, NGAL诱发CML机制通过小鼠实验模型已基本阐明。人NGAL同小鼠24p3蛋白高度同源性。小鼠正常细胞中, 白细胞介素(IL)-3能明显抑制24p3表达, 但其受体24p3R的表达不受任何影响^[24]。而在BCR-ABL⁺细胞中, NGAL表达呈明显上调, 其受体表达呈下调。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性测定实验证明, 24p3具有诱导其受体24p3R阳性细胞凋亡的作用。BCR-ABL⁺细胞能通过人类Runt相关转录因子基因-1(RUNX-1)召集组蛋白脱乙酰酶辅助阻遏物的相关成分Sina3a结合到受体24p3R的启动子区域, 使该区域的组蛋白脱乙酰化, 抑制受体表达。由此可见, 24p3并不诱导BCR-ABL⁺的白血病细胞发生凋亡。BCR-ABL⁺细胞能通过JAK/STAT5途径使磷酸化Stat5(a& b)结合到24p3启动子区域, 以此实现24p3表达上调。可见, BCR-ABL起双重作用, 通过上调肿瘤相关蛋白24p3和抑制受体24p3R表达, 使细胞发生恶性转化。另外, 24p3在CML发生过程中, 一方面能诱导正常血液细胞凋亡, 破坏正常造血机能; 另一方面能诱导白血病细胞的侵袭。

有研究表明, 在白血病的发病过程中, BCR-ABL和NGAL之间, 除了JAK/STAT通路, 可能还存在其他的通路, 目前还有待进一步研究。

(二)在肾脏损伤中的应用

肾脏发育基本特征是间质细胞向上皮细胞转化, 这种细胞类型的转变受输尿管芽分泌因子调节^[25]。有研究发现, 输尿管芽分泌因子中诱导上皮细胞形成NGAL^[26]。此外, NGAL还具有铁转运功能, 这一点与转铁蛋白相似。体内研究发现, NGAL结合含铁细胞, 将其转运至肾脏近曲小管, 若未发现NGAL, 则铁直接被转运至肝脏^[27]。早期原始肾上皮细胞摄取NGAL, NGAL通过转铁过程作用于基质细胞及早期原始上皮, 促进这些细胞增殖, 随后原始间质细胞向上皮分化, 产生肾单位样结构。NGAL促进早期原始肾上皮细胞的发生、生长, 但不参与其转化^[12]。可见, NGAL具有促进肾脏发育的作用。另外, NGAL在小鼠炎症或恶性化肾组织中结合含铁复合物, 使病情发展变缓, 减少肾近曲小管损伤及细胞凋亡, 保护肾功能, 维持肾近曲小管钙黏蛋白的完整性, 进而保护肾小管基底膜的极性及完整性^{[28, 29]}。NGAL在肾脏髓袢升支粗段及集合管产生, 随后分泌至尿液。尿NGAL浓度与肾脏急性损伤程度呈一致性^[30], 而在血容量不足导致氮质血症小鼠体内, 尿NGAL浓度并无升高^[31], 提示NGAL在进行性肾小管损伤中具有特异性。

2003年, Supavekin等^{[32, 33]}应用cDNA序列和减除杂交法及下游蛋白质组学分析技术, 在小鼠模型中发现NGAL是肾缺血早期上调最早、最明显、幅度最大的蛋白质。在缺血性、肾毒性药物性肾损伤早期就能在血及尿中检测到NGAL。2004年, Mishra等^[34]通过免疫印迹法检测发现, NGAL在高浓度顺氯氨铂作用后3 h内就能快速释放, 在尿中能检测到NGAL。通过免疫荧光法发现, NGAL主要产生于近曲小管细胞的点状细胞部位, 可能是一种分泌性蛋白。通过比较研究发现, 尿中N-乙酰基-β -D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidasein, NAG)或血中肌酐要在顺氯氨铂作用96 h后才能测到。研究进一步表明, 急性缺血再灌注术引起的肾脏损伤, 在3 h后就能测到NGAL^[30]。对儿童心脏手术后的前瞻性研究发现, 儿童心肺分流术后若并发急性肾损伤(acute kidney injury, AKI), 在术后2~6 h, 其血液和尿液中就能检测到NGAL, 其浓度是正常值的10倍以上^[35], 而血肌酐往往在术后1~3 d才增高。对成人心脏手术后并发AKI研究中发现, 其尿中NGAL水平同样明显升高^[36]。尿中NGAL上升是心脏手术后急性肾损伤的早期迹象^[37]。血浆B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide, BNP)联合血浆NGAL可预测及评价急性失代偿性心力衰竭术后风险^[38]。有研究表明, NGAL在血肌酐升高前就可被检测到, 其增高较其他指标更早, 如肾脏损伤分子(kidney injury molecular-1, KIM-1)、富半胱氨酸肝素结合蛋白61(cystein richprotein 61, Cyr-61)、β 2-微球蛋白、NAG等, 故可用做AKI的早期诊断指标。

除急性肾病外, NGAL也是慢性肾脏疾病(chronic kidney desease, CKD)的重要生物标记物。在CKD不同阶段, 尿NGAL可预测血肌酐值。Mori等^[28]研究了45例CKD 2~4期(按美国国家肾病基金会K/DOQ1分期标准)的6~21岁青少年, 发现NGAL和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)相关性很高, 同肾小球滤过率呈明显负相关, 血肌酐同血NGAL亦相关。Bolignano等^[39]评估NGAL在CKD发展进程的预测作用, 发现慢性肾小球肾炎患者体内NGAL含量高于CKD患者, CKD组为(378.28± 111.13)μ g/L, 对照组为(7.38± 3.26)μ g/L, 两者比较差异有统计学意义(P=0.01); 尿NGAL与血肌酐、尿蛋白相关。多囊肾是常染色体显性遗传病, 其尿和血中NGAL与残余肾小球滤过率有关, 囊性病变严重程度同NGAL呈正相关^[40], 可预测CKD严重程度。Mishra等^[30]研究发现, 慢性肾损伤患者体内NGAL含量增高, 其原因是活化肾小管上皮细胞在炎症刺激下产生, 当肾单位遭破坏后, 血肌酐也会随之增高, 而肾小球滤过率会下降。据此初步推断, NGAL可预测慢性肾损伤过程中的急性损伤, 其含量同急性损伤程度呈正相关。2011年又有学者发现, 人类免疫缺陷病毒相关性肾病(HIV-associated nephropathy , HIV-AN)患者尿NGAL明显高于其他类型肾病的免疫缺陷综合征患者, 可见NGAL对于HIV-AN也是极有价值的临床生物学标志^[41]。多项研究证实, NGAL是CKD及其严重程度的标志。

肾纤维化是一种病理生理改变, 是肾脏功能由健康到损伤, 再到损坏, 直至丧失的渐进过程。肾纤维化以细胞外基质(extacellular matrix, ECM)的异常沉积为特征。Yang 等^[42]通过小鼠实验, 将表达24p3的输尿管芽细胞处理分离, 推断NGAL通过增强钙依赖性跨膜糖蛋白E-cad表达, 阻止肾间质纤维化。另外, 在研究MMP-9在细胞内的存在形式时发现存在NGAL, 两者之间有密不可分联系。MMP-9可使Ⅳ 型胶原释放可溶性羟脯氨酸, 降解完整肾小球基底膜, MMP-1/TIMP-1是参与ECM降解的重要酶系, 而NGAL同MMP-9和TIMP-1形成三元复合物, 从某种程度上来说, NGAL可抵消三元复合物中TIMP-1对MMP-9活性抑制, 抑制肾纤维化。

(三)在炎症中的作用

NGAL是细菌化学趋化物N-甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(formyl methionyl leucyl phenylalanine, FMLP)的受体之一, 可诱导白细胞内颗粒释放, 趋化炎症细胞聚集, 消灭病原微生物^[43]。与炎症因子, 如IL-1、IL-2、IL-8和肿瘤坏死因子α (TNF-α )相互作用, 提示NGAL与炎症有关。NGAL对外界细菌具天然免疫力, 是一种急性时相蛋白, 其在呼吸道、胃肠道及泌尿道等组织器官中的表达一致。目前, 越来越多的研究表明, 在炎症相关的疾病中, 均有NGAL呈高表达状态, 如泌尿系统感染、胃肠道炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘等。NGAL在细菌性感染疾病中表现高表达, 其敏感性和特异性均> 95%^[44]。另一方面, NGAL可结合含铁复合物, 阻止微生物对铁的摄取, 从而抑制细菌生长。

综上所述, NGAL是一种新型蛋白, 在肿瘤、白血病、肾病、炎症等方面都有一定的相关性, 但很多确切的机制尚不明确, 还有待进一步深入研究。继续深化了解NGAL在各种疾病中的作用, 将为临床的诊断、治疗、预后提供更多、更好的手段。