引用本文
林萍, 赵雨璠, 吴悦, 张骁, 郭晓奎, 谭红略, 李擎天, 孙阳. 壳聚糖及其季铵盐对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响. 2012, 27(10): 10-854
LIN Ping, ZHAO Yufan, WU Yue, ZHANG Xiao, GUO Xiaokui, TAN Honglue, LI Qingtian, SUN Yang. The influence of chitosan and quaternized chitosan on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation . Labratory Medicine, 2012, 27(10): 10-854  
Permissions
Copyright©2012, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
壳聚糖及其季铵盐对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响
林萍1, 赵雨璠2, 吴悦2, 张骁2, 郭晓奎3, 谭红略4, 李擎天2, 孙阳5
1. 上海交通大学医学院附属上海市精神卫生中心检验科,上海 200030
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系,上海200025
3. 上海交通大学医学院病原生物学教研室,上海 200025
4. 上海交通大学医学院附属上海市第九人民医院,上海 200011
5.上海市同济医院医学科学研究所,上海 200065

作者简介:林 萍,女,1968年生,硕士,主任技师,主要从事临床医学检验工作。

通讯作者:孙 阳,联系电话:021-66111431。

基金:国家自然科学基金(81000708); “十一五”国家科技重大专项(2009ZX10004-712)
摘要
目的

探讨壳聚糖(CHI)及其衍生物可能具有的广谱抗菌作用。

方法

采用CHI、壳聚糖季铵盐(QCHI)进行铜绿假单胞菌体外抑菌试验。采用CHI和QCHI分别作用0、3、6、9、12 h,每个时间点取1 mL菌液进行菌落计数并与对照孔比较,同时抽提铜绿假单胞菌RNA,扩增其 ahpF、 pa3187、 aprA和 rpoS基因,并检测各基因表达水平;剩余铜绿假单胞菌用LB培养基培养3 d,PBS缓冲液冲洗浮游细菌,结晶紫染色,95%乙醇脱色后用酶标仪570 nm检测并比较铜绿假单胞菌生物膜的形成能力。

结果

与对照孔比较,自6 h起CHI和QCHI孔的存活菌量即有明显差异( P<0.05);但CHI孔和QCHI孔之间差异无统计学意义。CHI和QCHI均可使铜绿假单胞菌 pa3187基因表达上调, aprA基因表达下调;QCHI可使 ahpF基因表达下调,而CHI可使 ahpF基因表达上调;QCHI对 rpoS基因的表达有下调趋势。从6 h起,CHI和QCHI对铜绿假单胞菌生物膜的形成均有明显的抑制作用。

结论

CHI及QCHI能在一定程度上抑制铜绿假单胞菌的增殖及其生物膜的形成。

关键词: 壳聚糖; 壳聚糖季铵盐; 铜绿假单胞菌; 抑菌试验; 生物膜形成
文章编号:1673-8640(2012)10-0854
The influence of chitosan and quaternized chitosan on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation
LIN Ping1, ZHAO Yufan2, WU Yue2, ZHANG Xiao2, GUO Xiaokui3, TAN Honglue4, LI Qingtian2, SUN Yang5
1. Departemtn of Clinical Laboratory, Shanghai Mental Health Center, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200030, China
2. Faculty of Medical Laboratory Science, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
3. Laboratory of Pathogenic Biology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
4. Shanghai Nineth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China
5. Laboratory of Medical Science Institute, Shanghai Tongji Hospital, Shanghai 200065, China
Abstract
Objective

To investigate the broad-spectrum antibacterial efficacy of chitosan (CHI) and its derivatives.

Methods

The antibacterial test of Pseudomonas aeruginosa was performed by CHI and quaternized chitosan (QCHI). The volumes of per 1 mL at 0, 3, 6, 9 and 12 h by CHI and QCHI were determined. The results were compared with those of control hole volume. The Pseudomonas aeruginosa RNA was extracted simultaneously. The ahpF, pa3187, aprA and rpoS genes were amplified, and their expressions were determined. The remaining Pseudomonas aeruginosa were cultured by LB medium for 3 d. The floating bacteria were flushed by PBS buffer solution, and were stained by crystallization violet. After decolorizing by 95% ethanol, the biofilm formation function of Pseudomonas aeruginosa was analyzed by enzyme-labeled analyzer at 570 nm.

Results

There were significant differences between CHI and QCHI hole volumes of live bacteria after culturing 6 h compared with control hole volumes, but there was no obvious difference CHI and QCHI volumes. The pa3187 expression was increased by CHI and QCHI, but aprA expression was decreased by them. QCHI can decrease ahpF expression, but CHI can improve ahpF expression. The rpoS expression was also decreased by QCHI. Biofilm formation showed that the significant inhibitory effect could be seen in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by CHI and QCHI from culturing 6 h.

Conclusions

In a certain extent, CHI and QCHI can inhibit the proliferation and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa.

Keyword: Chitosan; Quaternized chitosan; Pseudomonas aeruginosa; Antibacterial test; Biofilm formation

医疗实践中各类侵入性器械如导管的广泛使用, 引起的导管相关性血液感染日趋严重, 其中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是导管相关性血液感染的最常见病原菌[1]之一, 因而具有抑菌性能的医用材质研发日益迫切。壳聚糖(chitosan, CHI)是甲壳素脱乙酰化的产物, 是一种来源丰富、可吸收降解的碱性天然聚氨基葡萄糖, 无毒、成膜性、絮凝性、可抑菌、可生物降解及良好的生物相容性等特点。与一般抑菌剂相比, CHI具有抑制性强、广谱、灭杀率高等优点, 已有研究证明CHI能够有效地抑制细菌和真菌的生长和繁殖[2, 3], 其衍生物壳聚糖季铵盐(quaternized Chitosan, QCHI)对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌也有抑制作用[4]。我们初步探讨CHI及QCHI对铜绿假单胞菌的抑制作用与效果。

材料和方法
一、材料
1. 研究对象

铜绿假单胞菌菌株P01由上海交通大学医学院附属瑞金医院提供, 经过生化表型鉴定及16s rDNA测序鉴定。CHI及QCHI抗菌片由上海交通大学医学院附属第九人民医院提供。

2. 试剂与仪器

细菌RNA抽提、反转录及定量PCR试剂盒均购自天根公司; 96孔细胞培养板购自BD公司; 荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在ABI 7500 FAST仪器(美国ABI公司)上进行。

二、方法
1. CHI及QCHI对铜绿假单胞菌的体外抑菌试验及基因表达检测

将96孔细胞培养板分别标记为对照和CHI、QCHI, 每孔加入LB培养基4.5 mL, 再各加入1× 106 CFU/mL浓度的铜绿假单胞菌培养液0.5 mL, 使各孔的菌液浓度均为1× 105 CFU/mL。在CHI、QCHI孔中分别加入CHI及QCHI抗菌片。细胞培养板置37 ℃培养, 于0 、3 、6 、9 h和12 h时分别从各孔取出0.9 mL菌液, 分别用于梯度稀释涂布平板法进行菌落计数, 同时抽提其RNA, 采用FQ-PCR检测铜绿假单胞菌的ahpF、pa3187、aprA和rpoS基因的表达情况。基因表达的上调或下调依据CHI孔或QCHI孔FQ-PCR结果与对照孔的比值确定, 比值> 2为表达上调, < 0.5为表达下调。RNA抽提、反转录及定量PCR均按照天根公司试剂说明书及ABI 7500 FAST仪器说明书进行。

2. 铜绿假单胞菌生物膜形成检测

将抑菌试验中所剩余的铜绿假单胞菌在LB培养基过夜培养, 调节细菌浓度至1× 109/mL, 取10 μ L加入96孔细胞培养板(3个复孔), 加入0.1× LB培养基200 μ L培养3 d。PBS缓冲液冲洗浮游细菌, 结晶紫染色20 min, 去离子水漂洗后加入95%乙醇脱色10 min, 将脱色液取出, 用酶标仪570 nm检测, 比较待测菌的生物膜形成能力。

表1 铜绿假单胞菌所用的引物序列
三、统计学方法

抑菌试验、基因表达检测及生物膜形成检测均进行3次独立实验, 取各自结果的平均值和标准差, 采用SAS12.6软件进行统计学分析, 不同实验组间的存活菌菌量比较、不同实验组生物膜检测的吸光度(A)值比较采用t检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、CHI、QCHI对铜绿假单胞菌的抑菌作用

与对照孔比较, 自6 h起, CHI及QCHI孔的存活菌量即有明显差异(P< 0.05), 且CHI及QCHI孔的存活菌量基本相同。由此可见CHI及QCHI对铜绿假单胞菌具有抑菌作用, 但二者之间的直接抑菌作用无明显差异(P> 0.05), 见图1。

图1 CHI、QCHI对铜绿假单胞菌的抑菌试验

二、CHI、QCHI对铜绿假单胞菌毒力基因表达的影响

CHI可使ahpF的表达上调, 而QCHI使ahpF的表达下调; QCHI和CHI均可使铜绿假单胞菌pa3187基因表达上调; aprA基因表达下调; QCHI可使rpoS基因的表达有下调趋势, 见表2。

表2 铜绿假单胞菌的ahpF、pa3187、aprA和rpoS基因表达情况
三、CHI及QCHI对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

对各组样本的铜绿假单胞菌生物膜形成检测发现, 从第6 h起, CHI和QCHI对铜绿假单胞菌的生物膜形成都有明显的抑制作用, 但CHI和QCHI对铜绿假单胞菌的生物膜形成的抑制作用之间差异无统计学意义(P> 0.05), 见图2。

图2 各组样本铜绿假单胞菌生物膜形成检测结果

讨论

CHI由天然多糖甲壳素经脱乙酰化处理而成, 是生物相容性和水解性较好的低聚糖, 具有较好的广谱抗菌性。CHI在抗菌织物研发等方面已经得到了较为广泛的应用[9]。CHI季铵化后, 成为阳离子大分子聚合物, 可与菌体细胞表面带有负电荷的蛋白质、磷壁酸、脂多糖等絮凝, 破坏细胞质膜渗透屏障作用, 导致菌体细胞完整性破坏; 或吸附带有负电荷的细菌, 干扰细胞壁合成使细胞溶解死亡[10]。

本研究结果显示, CHI和QCHI对铜绿假单胞菌有有效的抑菌作用。与对照孔相比, 自6 h起, CHI和QCHI孔的存活菌量有明显差异(P< 0.05), 且CHI和QCHI孔的存活菌量基本相同, 说明2种材料可明显抑制铜绿假单胞菌。另外, 前期研究[11]已经发现这2种CHI制剂具有缓释作用, 可成为应对铜绿假单胞菌感染的效用较为持久的辅助抗菌材料。目前, 认为QCHI的抗菌机制首先是吸附, 吸附后破坏细菌细胞膜, 使细胞质内的DNA和RNA溢出而达到抑菌效果。已有结果[12]显示QCHI的吸附作用强于CHI, 这可以初步解释QCHI的杀菌作用强于CHI。

本研究检测了铜绿假单胞菌ahpF、pa3187、aprA和rpoS基因的表达情况。其中, ahpF参与编码烷基过氧化物还原酶, 是铜绿假单胞菌细胞膜中重要的抗氧化成分, 与铜绿假单胞菌的泳动有关; pa3187编码的ABC转运结合蛋白可协助大分子进行穿膜转运; aprA编码碱性蛋白酶与细菌和抗菌肽等蛋白类制剂的作用有关; rpoS编码RNA聚合酶, 在细菌RNA合成和生物膜形成过程中有重要作用。在QCHI和CHI的作用下, 铜绿假单胞菌的pa3187基因表达有明显上调, 这说明QCHI和CHI对细菌细胞壁通透性和细胞膜的物质交换有明显影响。而2种制剂使aprA表达增加对抗菌肽等蛋白类抗菌制剂的作用是否有干扰还尚待研究验证。在rpoS表达检测中, QCHI对rpoS的表达有下调趋势, 表明QCHI可能对细菌的合成代谢, 尤其对生物膜合成有明显影响。值得注意的是, QCHI和CHI对ahpF的表达影响相反, 其中的机制值得进一步研究分析。

生物膜的形成在铜绿假单胞菌引起的导管相关细菌感染中起重要作用[10]。本研究检测了铜绿假单胞菌生物膜形成的变化, 结果显示CHI和QCHI均能够有效抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成, 二者的抑制作用在12 h内并无区别。QCHI既保持了CHI原有的生物相容性、无毒、可生物降解和成膜性能等, 又在溶解性、抑菌性、保湿性和絮凝性等方面有明显的改善与提高, 使其在生物医学领域和废水处理等方面的应用日趋重要。此外, QCHI能有效抑制红色毛癣菌和石膏样小孢子菌的生长, 且抑菌效果随着CHI衍生物相对分子质量的增加而增加[2]。

总之, CHI和QCHI对铜绿假单胞菌均能产生有效的直接抑菌作用且能够抑制生物膜的形成。而QCHI更能影响与生物膜形成相关的多个基因表达, 表明QCHI可能成为未来有效应对铜绿假单胞菌等病原菌引发医院和社区感染的有效手段, 拓展其在医药材质领域的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Tumbarello M, Repetto E, Trecarichi EM, et al. Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections: risk factors and mortality[J]. Epidemiol Infect, 2011, 139(11): 1740-1749. [本文引用:1]
[2] Sajomsang W, Gonil P, Saesoo S, et al. Antifungal property of quaternized chitosan and its derivatives[J]. Int J Biol Macromol, 2012, 50(1): 263-269. [本文引用:2]
[3] Ignatova M, Manolova N, Markova N, et al. Electrospun non-woven nanofibrous hybrid mats based on chitosan and PLA for wound-dressing applications[J]. Macromol Biosci, 2009, 9(1): 102-111. [本文引用:1]
[4] Fernand es JC, Tavaria FK, Soares JC, et al. Antimicrobial effects of chitosans and chitooligosaccharides, upon Staphylococcus aureus and Escherichia coli, in food model systems[J]. Food Microbiol, 2008, 25(7): 922-928. [本文引用:1]
[5] Perez-Osorio AC, Williamson KS, Franklin MJ. Heterogeneous rpoS and rhlR mRNA levels and 16S rRNA/rDNA (rRNA gene) ratios within Pseudomonas aeruginosa biofilms, sampled by laser capture microdissection[J]. J Bacteriol, 2010, 192(12): 2991-3000. [本文引用:1]
[6] Tremblay J, Deziel E. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa swarming motility[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 587. [本文引用:1]
[7] Turner KH, Vallet-Gely I, Dove SL. Epigenetic control of virulence gene expression in Pseudomonas aeruginosa by a LysR-type transcription regulator[J]. PLoS Genet, 2009, 5(12): e1000779. [本文引用:1]
[8] Onguru P, Erbay A, Bodur H, et al. Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors for nosocomial infections[J]. J Korean Med Sci, 2008, 23(16): 982-987. [本文引用:1]
[9] Friedman M, Juneja VK. Review of antimicrobial and antioxidative activities of chitosans in food[J]. J Food Prot, 2010, 73(9): 1737-1761. [本文引用:1]
[10] Li P, Poon YF, Li W, et al. A polycationic antimicrobial and biocompatible hydrogel with microbe membrane suctioning ability[J]. Nat Mater, 2011, 10(2): 149-156. [本文引用:2]
[11] Tan H, Peng Z, Li Q, et al. The use of quaternised chitosan-loaded PMMA to inhibit biofilm formation and downregulate the virulence-associated gene expression of antibiotic-resistant staphylococcus[J]. Biomaterials, 2012, 33(2): 365-377. [本文引用:1]
[12] Chen YM, Chung YC, Wang LW, et al. Antibacterial properties of chitosan in waterborne pathogen[J]. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng, 2002, 37(7): 1379-1390. [本文引用:1]