引用本文
卢仁泉, 张菁, 高翔, 郭林. MR-1S融合蛋白的表达、纯化与保存及其抗血清的制备. 2012, 27(10): 835-839
LU Renquan, ZHANG Jing, GAO Xiang, GUO Lin. Expression, purification and preservation of myofibrillogenesis regulator 1S recombinant protein and its antiserum preparation. Labratory Medicine, 2012, 27(10): 835-839  
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MR-1S融合蛋白的表达、纯化与保存及其抗血清的制备
卢仁泉, 张菁, 高翔, 郭林
复旦大学上海医学院肿瘤学系、复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海 200032

作者简介:卢仁泉,男,1975年生,硕士,主管技师,主要从事临床免疫学和分子生物学工作。

通讯作者:高 翔,联系电话:021-64175590-2204。

摘要
目的

通过人肌纤生成调节因子1(hMR-1S)基因重组表达获得MR-1S-His融合蛋白,纯化后制备抗MR-1S抗血清;同时确定该蛋白保存的稳定体系,为研究MR-1S蛋白理化性质及其功能提供关键的原料。

方法

利用原核表达载体pET21a(+),构建pET21a-MR-1S重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导MR-1S-His融合蛋白表达,亲和纯化后Western blot鉴定;进一步用该融合蛋白免疫新西兰兔,制备抗MR-1S的多克隆抗体。同时通过在不同温度条件下,对4种不同的稳定体系中保存后蛋白活性测定进行比较,确定最合适的稳定保存体系及条件。

结果

构建了重组质粒pET21a-MR-1S,并在BL21中进行可溶性表达,经Western blot鉴定确认;免疫新西兰兔获得了抗MR-1S抗血清;确定了合适的稳定体系及保存条件。

结论

在非变性条件下实现了可溶性MR-1S融合蛋白的表达和稳定保存,进一步制备的抗MR-1S抗血清为研究MR-1S的性质及功能奠定了基础。

关键词: 肌纤维生成调节因子1; 分子克隆; 抗体
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)10-0835-05
Expression, purification and preservation of myofibrillogenesis regulator 1S recombinant protein and its antiserum preparation
LU Renquan, ZHANG Jing, GAO Xiang, GUO Lin
Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Department of Clinical Laboratory, Shanghai Cancer Center, Fudan University, Shanghai 200032, China
Abstract
Objective

To obtain the myofibrillogenesis regulator 1S (MR-1S)-His recombinant protein through the expression of MR-1S gene and prepare anti-MR-1S antiserum after purification. To identify the stable system to preserve the recombinant protein, and to provid the reference for the investigation of MR-1S protein characteristics and biological function.

Methods

The recombinant plasmid pET21a-MR-1S was constructed with pronucleus expression vector pET 21a(+) and transferred into Escherichia coli BL21 (DE3), and the expression of MR-1S recombinant protein was induced by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The MR-1S recombinant protein was purified by affinity chromatography and identified by Western blot. The anti-MR-1S polyclonal antibodies were prepared by the rabbit-immunized technique. With comparison of the protein activities of 4 stable systems under different temperatures, the most suitable stable preservation system and condition were picked out.

Results

Recombinant plasmid pET21a-MR-1S was established,and the MR-1S-His recombinant protein was expressed solubly in Escherichia coli BL21(DE3) by the identification of Western blot. The anti-MR-1S antisera were obtained by immunization rabbit, and the satabilization system and preservation condition were definited.

Conclusions

Under undenatured conditions, the soluble MR-1S recombinant protein is expressed and can be preserved stably, and it lays the foundation for MR-1S characteristices and biological function studies.

Keyword: Myofibrillogenesis regulator 1; Molecular cloning; Antibody

人肌纤生成调节因子-1(human myofibrillogenesis regulator 1, hMR-1)是近年从人骨骼肌cDNA文库中克隆得到的一个人类新功能基因, GenBank收录号为AF417001[1]。该基因定位于2q35, 编码一个142个氨基酸组成的蛋白质, 因其在3种转录剪切异构体中长度最短, 故也称为MR-1S[2]。MR-1S在心肌、骨骼肌和肝脏中高表达, 并且参与诱导心肌肥大的发生[3, 4]; 并且与发作性非运动源性运动障碍(paroxysmal nonkinesigenic dyskinesia, PNKD)的发生、发展密切相关。近年来开始有文献报道, MR-1S和肿瘤的发生密切相关, 在肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移发挥了重要作用[5]。

MR-1S作为一个新的功能分子, 对于其特性和作用方面的研究还刚刚兴起, 虽有文献报道了MR-1S基因的初步功能[6, 7]; 但从分子和细胞水平上具体阐述MR-1S在心肌肥大、PNKD和肿瘤等中的作用及其机制显得尤为重要, 其中特别是最近报道的在肿瘤细胞信号传递通路中发挥的作用[5, 8]。总之, 有关MR-1S分子的理化性质、功能以及与疾病之间的具体关系不甚清楚, 有待进一步探讨。因而, 我们主要进行MR-1S蛋白的表达、纯化和确定适合其保存的稳定体系以及进一步免疫动物获得抗MR-1S的抗体, 为后期研究该新蛋白分子的理化特性、功能及相关的作用机制奠定基础。

材料和方法
一、材料

1. 质粒、菌株和细胞

质粒pUCm-T、菌株DH5α 、BL21(DE3)由本实验室保存; 质粒pET21a为教育部分子医学重点实验室惠赠; 人卵巢癌SKOV3细胞由上海市肿瘤研究所提供。

2. 引物的设计及合成

根据GenBank的人MR-1S序列, 设计一对引物(P1:5'-CG-GGATCCATGGCGGCGGTGGTAGCTGC-3'; P2:5'-CCGCTCGAGTCAGGTCTGCACCCCAGAC-3'; 分别引入BamH I和Xhol I酶切位点 (如下划线所示), 引物由上海生工生物公司合成; 目的产物片段G、C含量为60.8%, 长度为429 bp。

3. 主要试剂

Trizol试剂购自Invitrogen公司; 质粒提取试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氮川三乙酸(NTA)树脂购自上海申能博彩生物科技有限公司; 限制性内切酶BamH I、Xhol I、T4 DNA连接酶购自NEB公司; Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司; 鼠抗His抗体和HRP-兔抗鼠IgG购自天根生物公司; 蛋白定量试剂(BCA法)购自联科生物公司; 增强化学发光(ECL)底物购自Pierce Biotech公司。

二、方法

1. 逆转录聚合酶链反应(PCR)扩增人MR-1S基因

培养SKOV3细胞至对数期, 计数约为2× 106个细胞, 严格按Trizol试剂说明书提取其总RNA。以Oligo dT为引物, 常规方法逆转录合成cDNA[9]。50 μ L PCR扩增体系为:cDNA 1 μ L, 10× Taq buffer 5 μ L, 2.5 mmol/L dNTP 5 μ L, 上下游引物各1 μ L, Taq聚合酶 1 μ L, 去离子水36 μ L; 反应条件:94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s, 36个循环后, 72 ℃延伸10 min; PCR产物纯化试剂盒回收该扩增产物。

2. MR-1S重组表达质粒的构建及鉴定

上述3μ L PCR产物与1μ L pUCm-T载体于16 ℃连接4 h; 转化DH5α , 接种至含X-gal的含氨苄西林琼脂平板(LBA), 37 ℃16~24 h。挑白色菌落培养后, 提取质粒进行酶切和测序鉴定。测序正确的质粒经BamH I和Xhol I双酶切后, 回收目的基因片段, 与同样酶切处理的pET21a连接过夜。转化表达菌BL21中, LBA平板上37 ℃培养过夜, 挑取阳性克隆酶切鉴定。

3. 人MR-1S融合蛋白的表达

将上述鉴定正确的阳性克隆菌扩大培养至对数生长期, 分别用不同终浓度的IPTG(0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L)以及不同温度条件下(28 ℃、30 ℃和35 ℃)诱导0、1、2、3、4和5 h后, 7 500× g离心10 min, 收集菌体。用10 mmol/L PBS(pH值 7.4)悬浮菌体, 加入0.3 mg/mL溶菌酶。超声裂解后, 加入10 μ g/mL DNase, 12 000× g离心10 min, 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析上清及沉淀中融合蛋白的表达情况。

4. MR-1S融合蛋白纯化及鉴定

将原核表达的MR-1S-His融合蛋白在非变性条件下经NTA柱纯化, 用不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白, PBS透析; SDS-PAGE确定最佳洗脱的咪唑浓度。将纯化产物和诱导前BL21菌裂解物经SDS-PAGE后, 转印至聚丙二氟乙烯膜(PVDF)膜上, 5%脱脂奶粉封闭过夜; 分别与鼠抗His抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG作用, 加增强化学发光(ECL) A、B液, X胶片显影。

5. 兔抗MR-1S抗血清的制备

将上述纯化制备的MR-1S融合蛋白用作抗原, 与弗氏完全佐剂充分乳化后, 背部多点注射免疫2只新西兰兔, 间隔2周后再同上于相同部位选不同点注射; 每次免疫的抗原量约100 μ g, 第3次起用弗氏不完全佐剂, 每次间隔2周, 共免疫5次; 末次免疫1周后耳缘静脉取血检测抗体效价。效价达到要求, 心脏采血, 5 000× g离心10 min, 收集血清, 分装, -70 ℃保存。

6. MR-1S融合蛋白稳定体系的比较

配制如下4种稳定体系。稳定体系1:含3 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS; 稳定体系2:含20%小牛血清的PBS; 稳定体系3:含2 mmol/L CaCl2、10%牛血清白蛋白(BSA)的PBS; 稳定体系4:含10%BSA、50%甘油的PBS。再将纯化的融合蛋白分别用这4种稳定体系作1∶ 10稀释, 分2等份贮存于4 ℃、37 ℃各3 d、1周、2周、1个月。测定前, 用PBS配制6个浓度梯度的MR-1S标准液(1、2、4、8、16、32 μ g/mL); 取100 μ L上述标准液和不同稳定体系保存的样本加至96孔聚苯乙烯板中, 每个样本做重复孔, 4 ℃过夜; 每孔加封闭液200 μ L, 37 ℃孵育2 h; 洗孔后用1∶ 100稀释的兔抗MR-1S 多抗100 μ L加入各孔内, 37 ℃孵育1 h, 洗孔, 加1∶ 2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG 50 μ L, 37 ℃孵育1 h; 洗涤, 加底物缓冲液100 μ L, 37 ℃ 30 min, 加2N H2SO4 50 μ L终止反应, Bio-tek酶标仪在波长490 nm下测定A值。根据标准液的工作曲线, 换算出不同稳定体系中的样本浓度。

结果
一、目的基因的扩增、重组表达质粒的构建及鉴定

MR-1S基因通过PCR扩增后, 产物经琼脂糖凝胶电泳, 片段大小为429 bp, 见图1(a)。与pUCm-T载体连接、转化, 阳性克隆送测序, 结果显示该重组质粒已插入的MR-1S序列完全正确。经BamHI、Xhol I双酶切、回收目的DNA片段, 与同样双酶切的pET21a连接, 转化DH5α , 扩菌后提取重组质粒, 双酶切后能得到400 bp左右的片段, 条带与预期一致, 见图1(b)。

图1 目的基因的扩增产物及重组质粒的电泳鉴定

二、MR-1S融合蛋白的诱导表达

对诱导条件摸索与比较, 发现在30 ℃、IPTG 浓度为0.5 mmol/L条件下, 诱导5 h MR-1S融合蛋白表达量最多。该条件下, BL2I/pET21a-MR-1S诱导表达产物经SDS-PAGE显示, 相对分子质量21 000处有1条浓缩的条带, 占总蛋白含量的40% 以上, 见图2。同时发现诱导后超声上清和沉淀中均有目的蛋白表达, 但是大部分在超声上清中, 仅少量在超声沉淀, 说明融合蛋白呈可溶性的表达。

图2 BL2I/pET21a-MR-1S在30 ℃、0.5 mmol/LIPTG诱导后表达产物的SDS-PAGE

三、表达产物的纯化及鉴定

上述成功诱导表达的MR-1S-His融合蛋白, 裂解上清在非变性条件下经NTA柱亲和层析纯化, 用50和100 mol/L咪唑洗脱后目的蛋白得率、纯度均较高, 见图3(a)。将这2种浓度下的洗脱产物, 合并后用PBS透析。按BCA法试剂说明书测定蛋白浓度, 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度, 测得纯化的融合蛋白浓度约为820 μ g/mL, 备用。该纯化产物和诱导前BL21菌裂解物进行Western blot分析, 发现仅纯化产物在21 000处有一条明显的发光条带, 证明已有目的蛋白存在, 条带较特异, 见图3(b)。

图3 MR-1S融合蛋白纯化产物及其Western blot鉴定

四、兔抗MR-1S抗血清的制备

2只新西兰兔经5次免疫后, 心脏采血, 其中1号兔(R1)效价稍高, 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定效价均达到1∶ 40 000以上 (抗原包被浓度为10 μ g/mL), 结果见表1。用这2种抗血清经饱和硫酸胺纯化后, 用Western blot验证其效价, 结果表明用于Western blot检测其抗体的最大稀释度均可达到1∶ 5 000。

表1 抗血清ELISA检测的结果
五、MR-1S融合蛋白稳定体系确定

在37 ℃(快速老化试验)时, 稳定体系1、2中MR-1S融合蛋白的活性随时间(3 d、1周、2周、1月)而有所下降, 但较稳定体系3、4下降幅度小, 此时稳定体系1相对最好。4 ℃存放实验, 同样也是稳定体系1、2的活性较高, 其中稳定体系2活性随时间变化, 活性衰减稍明显, 而稳定体系1随时间变化对目的蛋白活性影响不大。总之, 4 ℃保存较适宜, 稳定体系1是其中较合适的稳定体系。

图4 不同稀释度兔抗MR-1S抗血清的Western blot检测结果

图5 MR-1S融合蛋白稳定体系的比较

讨论

本研究主要是对MR-1S进行基因克隆、蛋白表达和纯化, 以及兔抗MR-1S多抗的制备, 同时也探索有利于MR-1S融合蛋白保存的稳定条件, 为MR-1S作为新肿瘤标志在临床诊疗中的应用奠定基础。首先, 将MR-1S基因接入原核表达载体pET21a, 构建可用于表达的重组质粒。pET载体系列是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统, 能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达, 本研究实现了MR-1S-His融合蛋白的可溶性表达, 这是已有研究的进一步改进[10]。

另外, 应用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌诱导蛋白表达时发现, 30 ℃有利于非变性条件下pET21a-MR-1S重组质粒的诱导表达及纯化。在MR-1S-His融合蛋白纯化中, 裂解产物沉淀中包涵体纯化较难, 可溶性表达在上清中进行纯化则较易获得目的蛋白。本研究采用E.Coli宿主菌BL21(DE3), 在于其优点缺失Lon和OmpT蛋白酶, 用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因, T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区, 该区整合于BL21的染色体上[11]。因而, 在诱导表达中, pET21a-MR-1S成功地实现蛋白表达。在λ 噬菌体DE3溶原菌中, T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5启动子控制[12]。值得一提的是, 可能由于表达一些有活性蛋白, 要求一个或2个末端没有外源序列, 而pET载体就能够克隆非融合序列, 然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用, 表达水平就可能受影响。因此, 本研究利用了有效表达的氨基末端序列来构建了融合蛋白。本研究诱导表达的MR-1S-His融合蛋白条带位置出现在21 000左右, 与预计值相当。

此外, 本研究还摸索了MR-1S融合蛋白诱导表达的条件, 目的蛋白的表达量受多种因素如温度、时间、IPTG浓度、培养基等的影响[13], 只有载体、宿主菌和培养条件组合合适才可能用于表达后的大量纯化, 所以我们对诱导条件进行一些优化, 本研究显示MR-1S对于诱导温度较敏感, 实验发现pET21a-MR-1S诱导温度控制在30 ℃, 要优于28 ℃和35 ℃; 同时发现, 在0.5 mmol/L IPTG条件下, 诱导5 h表达量最多。

本研究也对MR-1S-His融合蛋白进行了纯化, 因为诱导表达后SDS-PAGE发现目的蛋白存在于上清和沉淀中, 但沉淀中较少, 故使用非变性的NTA层析柱纯化的方法成功获得目的蛋白。获得的融合蛋白透析后可用于标准品的配制和抗血清的制备, 因而有必要研究MR-1S融合蛋白的稳定体系。实验发现, 4 ℃条件下, 稳定体系1较利于MR-1S融合蛋白的保存。稳定体系1中主要成分为EDTA和PBS。EDTA是一种络合物, 可结合稳定体系及融合蛋白溶液中的离子, 形成稳定的水溶性络合物, 有利于融合蛋白的保存, 同时也与一些二价离子的结合, 使得空间结构稳定, 使其保持较好的免疫反应性; 稳定体系2的主要成分为血清基质, 血清基质与蛋白与体内的生存环境较为相似, 也可用于融合蛋白保存。而稳定体系3中含有CaCl2, Ca2+易改变MR-1S的蛋白空间构象, 从而影响其活性, 故稳定体系3的活性下降较多。总之, 稳定体系1、2有利于保持MR-1S的活性, 特别是稳定体系1更适合用于MR-1S融合蛋白的储存。

MR-1S蛋白作为一种新的功能蛋白, 在临床应用特别是肿瘤诊疗中, 具有较好的应用前景。本研究成功克隆出hMR-1S基因、重组表达了MR-1S蛋白、纯化并确定适合其保存的稳定体系以及进一步免疫动物获得抗MR-1S的抗体, 为进一步深入评估其功能以及研究其作用机制奠定了坚实的基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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