引用本文
梁夯, 冯志军, 李立和, 张学英, 李晓燕. 血清肌酐二步酶法检测新技术研究. 2012, 27(10): 809-812
LIANG Hang, FENG Zhijun, LI Lihe, ZHANG Xueying, LI Xiaoyan. Investigation on the new two-step enzymatic method for the detection of serum creatinine. Labratory Medicine, 2012, 27(10): 809-812  
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《检验医学》编辑部
血清肌酐二步酶法检测新技术研究
梁夯1, 冯志军1, 李立和2, 张学英1, 李晓燕1
1. 天津市大港油田总医院检验科,天津 300280
2. 天津市宝坻区人民医院检验科,天津 301800

作者简介:梁夯,男,1970年生,副主任技师,主要从事生物化学检验项目的诊断性研究。

摘要
目的

探讨二步酶法测定肌酐的实验方法。

方法

以肌酐酰氨基水解酶为试剂Ⅱ,以N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)和4-氨基安替比林(4-AAP)色原物作为试剂Ⅰ,建立二步酶法测定血清肌酐。通过内空白法消除内源性肌酸和改变光谱吸收方法消除脂血、溶血、黄疸干扰。采用二步酶法测定36例患者血清肌酐,并与高效液相色谱(HPLC)法和一步酶法比较;同时测定200名健康体检者血清肌酐,以建立参考范围。

结果

患者组肌酐二步酶法结果[(84.2±26.6) μmol/L]明显低于一步酶法[(116.6±29.6) μmol/L, t=32 .12, P<0.01];与HPLC法测定结果[(83.9±26.8)μmol/L]差异无统计学意义( t=0 .541 6, P>0.05),且呈良好相关性( Y二步酶法=1.042 XHPLC法-0.182 1, r2=0.982 4)。二步酶法测定血清肌酐的线性范围达4 500 μmol/L,平均回收率为100.8%,批内和批间变异系数( CV)分别为2.91%~4.20%和3.20%~4.60%,应用二步酶法每天测定室内质控定值血清[低(78.0 μmol/L)、中(206.0 μmol/L)、高(900.0 μmol/L)],共测定180 d,其日间总 CV分别为4.46%、5.27%、7.24%。二步酶法试剂至少能稳定180 d。健康人群血清肌酐的参考范围男性为56~132 μmol/L,女性为41~109 μmol/L。

结论

以肌酐酰氨基水解酶为试剂Ⅱ和以HDAOS、4-AAP为色原物(试剂Ⅰ)的二步酶法可以消除肌酸和脂血、溶血、黄疸血的干扰,可用于临床肌酐常规测定。

关键词: 肌酐; 二步酶法; 内空白法; N-(2-羟基-3-磺丙基)-3; 5-二甲氧基苯胺钠盐; 内源性干扰
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)10-0809-04
Investigation on the new two-step enzymatic method for the detection of serum creatinine
LIANG Hang1, FENG Zhijun1, LI Lihe2, ZHANG Xueying1, LI Xiaoyan1
1. Department of Clinical Laboratory,Oilfield Hospital of Tianjin Dagang, Tianjin 300280,China
2. Department of Clinical Laboratory,the People's Hospital of Tianjin Baodi,Tianjin 301800,China
Abstract
Objective

To investigate the two-step enzymatic method for the detection of serum creatinine.

Methods

The two-step enzymatic method for the detection of serum creatinine was established using creatinine amidohydrolase as the reagent Ⅱ and N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt(HDAOS)and 4-mino-antipyrine (4-AAP) as the reagent Ⅰ. The inner blank method was used to eliminate endogenous creatine, and altered spectral absorption method was used to eliminate the interference of lipemia, hemolysis and jaundice. The levels of serum creatinine in 36 patients were determined by the two-step enzymatic method. The results were compared with those of high performance liquid chromatography (HPLC) and single-reagent method. The serum creatinine levels of 200 healthy subjects were determined and performed as reference range.

Results

There was significant difference between two-step enzymatic method[creatinine:(84.2±26.6)μmol/L] and single-reagent method [creatinine:(116.6±29.6)μmol/L, t=32 .12, P<0.01],whereas there was no statistical significance between two-step enzymatic method and HPLC [creatinine:(83.9±26.8)μmol/L, t=0 .541 6, P>0.05], and showed good correlation ( Ytwo-step enzymatic method =1.042 XHPLC-0.182 1, r2=0.982 4). The liner range of the two-step enzymatic method for the detection of serum creatinine was up to 4 500 μmol/L,the average rate of recovery was 100.8%, and the within-run coefficient of variation ( CV) and between-run CV were 2.91%-4.20% and 3.20%-4.60%. The sera [low level: 78.0 μmol/L, middle level: 206.0 μmol/L and high level: 900.0 μmol/L] were determined by the two-step enzymatic method for 180 d. The interday CV were 4.46%, 5.27% and 7.24%. The reagents of the two-step enzymatic method could be stable at least for 180 d. The reference range of serum creatinine in healthy males was 56-132 μmol/L, and that in healthy females was 41-109 μmol/L.

Conclusions

The two-step enzymatic method based on creatinine amidohydrolase as reagent Ⅱ and based on HDAOS and 4-AAP as reagent Ⅰ could eliminate the interference of creatine,lipemia, hemolysis and jaundice, and it can be applied as routine test.

Keyword: Creatinine; Two-step enzymatic method; Inner blank method; N-(2-hydrroxt-3-sulfopropyl)-3; 5-dimethoxyaniline sodium salt; Endogenous interference

临床实验室对于血和尿中肌酐的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法)。Jaffe法虽然试剂较便宜, 重复性、准确性也较好, 但易受血清中其他假性肌酐物质的干扰。肌酐氧化酶法也易受内源性肌酸的影响[1]。为此, 我们建立了一种经济、方便、易行、准确性高、能够不受内源性肌酸影响的测定血清及尿液中肌酐的二步酶法。

材料和方法
一、主要试剂与仪器

1.样本来源

选择天津大港油田总医院门诊及住院患者36例, 男18例, 女18例, 年龄(15~65)岁, 空腹静脉采血2 mL。同时选择200名体检合格成年人, 无高血压、冠心病、糖尿病及其他肝、脑、肾脏等疾病, 男100名, 女100名, 年龄(18~60)岁, 空腹静脉采血, 用以建立参考范围。

2.一步酶法

采用北京利得曼公司一步酶法试剂, 测定条件为样本∶ 试剂=1∶ 100、温度37 ℃、反应时间8.1 min、600 nm终点法比色测定, 采用265 mmol/L肌酐水溶液定标。

3.二步酶法

试剂Ⅰ :每升磷酸盐缓冲液内含N-(2-羟基-3-磺丙基)-3, 5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)1.0 mmol、4-氨基安替比林(4-AAP)3.0 mmol、抗坏血酸氧化酶20 kU、过氧化物酶(POD) 50 kU、肌氨酸氧化酶40 kU、肌酸脒基水解酶40 kU、防腐剂(Proclin-300)200 μ L; 试剂Ⅱ :每升磷酸盐缓冲液内含肌酐酰氨基水解酶500 kU、Proclin-300 200 μ L。测定条件为样本∶ 试剂Ⅰ ∶ 试剂Ⅱ =1∶ 75∶ 25、温度37 ℃。样本与试剂Ⅰ 温育5 min, 加入试剂Ⅱ , 反应5 min, 600 nm终点法比色测定, 采用经标定肌酐物质定标。

4. 高效液相色谱(HPLC)法

采用岛津LC-10A高效液相色谱仪, 色谱柱为2QRBX XDB-C18(4.6 mm× 50.0 mm), 流动相为0.02 mmol/L KH2PO4缓冲液, 流速为1.10 mL/min, 检测波长为265 nm[2]。

5. 生化分析仪

采用日本日立7180型全自动生化分析仪。

二、二步酶法原理

试剂Ⅱ 内仅含有肌酐酰氨基水解酶及适量防腐剂; 其他酶有效成分及色原物质同在试剂Ⅰ 中, 由于肌酸和肌酐水解反应生成的肌酸先后呈色, 故可计算出仅肌酐水解反应中生成的肌酸, 避免了样本中肌酸的干扰。

第1步反应:

肌酸+ H2O+O2 肌氨酸+尿素 (1)

肌氨酸+ H2O+O2 甘氨酸+甲醛+ H2O2 (2)

H2O2+4-AAP+HDAOS 兰色醌亚胺+2H2O+HCl (3)

第2步反应:

肌酐+ H2O 肌酸 (4)

肌酸+ H2O+O2 肌氨酸+尿素 (5)

肌氨酸+ H2O+O2 甘氨酸+甲醛+ H2O2 (6)

H2O2+4-AAP+HDAOS 蓝色醌亚胺+2H2O+HCl (7)

三、方法学评价
1. 精密度试验

取高(78.0 μ mol/L)、中(206.0 μ mol/L)、低(900.0 μ mol/L)定值血清分别连续测定20次, 计算批内变异系数(CV); 取高、中、低定值血清连续测定20 d, 计算批间CV。

2. 线性范围

取肌酐浓度为7 200 μ mol/L的高值质控血清分别稀释为1/7、2/7、3/7、4/7、5/7、6/7、7/7, 其测定值最大值即为线性范围。

3. 回收试验

在已测得肌酐为 122 μ mo1/L的血清样本中分别加入不同量的肌酐标准品进行回收试验, 计算回收率。

四、统计学方法

应用NOSA V2.3统计学软件进行统计。结果采用 x̅± s表示, 组间比较采用t检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、3种方法肌酐测定结果比较

二步酶法与HPLC法测定结果差异无统计学意义(t=0.541 6, P> 0.05), 呈良好相关性(Y二步酶法=1.042XHPLC法-0.182 1, r2=0.982 4), 见图1。二步酶法测定结果为真正肌酐, 测定结果明显低于一步酶法(P< 0.01), 一步酶法测定结果为肌酐与肌酸之和, 见表1。

图1 二步酶法与HPLC法测定结果的回归曲线

表1 3种方法测定患者血清肌酐结果比较( x̅± s, μ mol/L)
二、二步酶法与一步酶法测定肌酐实时反应曲线比较

结果见图2、3。

图2 一步酶法测定肌酐实时反应曲线

图3 二步酶法测定肌酐实时反应曲线

三、精密度试验

二步酶法批内和批间CV结果见表2。

表2 高、中、低值肌酐批内、批间CV结果
四、试剂稳定性

应用二步酶法每天测定低(78.0 μ mol/L)、中(206.0 μ mol/L)、高(900.0 μ mol/L)值室内质控定值血清, 共测定180 d, 其日间总CV分别为4.46%、5.27%、7.24%。说明该试剂至少能稳定半年。

五、线性范围

取一肌酐浓度为7 200 μ mol/L的高值质控血清分别稀释为1/7、2/7、3/7、4/7、5/7、6/7、7/7。二步酶法的线性范围达4 500.0 μ mol/L, 见图4。

图4 二步酶法的线性范围

六、回收试验

在已测得肌酐为 122 μ mo1/L的血清样本中分别加入不同量的肌酐标准品进行回收试验, 平均回收率为100.8%, 见表3。

表2 二步酶法血清肌酐检测回收率
七、参考范围

用二步酶法测定200名健康人群(男、女各100名)血清肌酐, 参考范围( x̅± 2s)分别为男 56~132 μ mol/L、女 41~109 μ mol/L。

讨论

酶法利用肌酐在肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、POD等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺。但目前方法中, 不管是一步酶法和二步酶法测定过程中肌酐水解后产生的肌酸和内源性肌酸同时转化为醌亚胺, 肌酐测定结果包括肌酐和肌酸之和。正常男性血肌酐参考范围为53~106 μ mol/L, 女性44~88 μ mol/L; 正常男性血肌酸参考范围为15~45 μ mol/L, 女性为30~80 μ mol/L。当发生急性肌损伤、饥饿、糖尿病、营养不良、甲状腺功能亢进、发热时肌酸显著升高, 对肌酐造成的偏差更显著[3]。且前二步酶法商品化试剂是以肌酐酰氨基水解酶、POD和4-AAP为试剂Ⅱ , 且在试剂Ⅰ 中加入过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的H2 O24。但问题是过氧化氢酶可能会分解第2步反应中产生的H2O2, 从而影响测定结果。

本研究所用的方法不同于以肌酐酰氨基水解酶和苯酚的衍生物为试剂的方法, 而是将肌酐氧化酶法试剂分为2个部分, 其中试剂Ⅱ 内仅含有肌酐酰氨基水解酶, 其余为试剂Ⅰ 。本方法虽与原有的二步酶法成分相同, 只是仅将肌酐酰氨基水解酶放入试剂Ⅱ , 由于试剂Ⅰ 中含有双色原物质, 内源性肌酸和肌酐水解后产生的肌酸先后转化为醌亚胺, 肌酐的测定效果明显不同。第1步反应体系中有4-AAP和HDAOS色原物而没有肌酐酰氨基水解酶, 内源性肌酸经肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶作用产生H2O2, 在POD作用下, H2O2与HDAOS、4-AAP经氧化和转氨基作用生成蓝色醌类化合物, 内源性肌酸被转化而被耗尽, 当加入肌酐酰氨基水解酶后启动肌酐水解反应生成肌酸, 再经肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶作用产生H2O2, 在POD作用下, H2O2与HDAOS、4-AAP经氧化和转氨基作用生成蓝色醌类化合物。内源性肌酸和肌酐分解的肌酸先后显色, 仪器以第1步反应产生的蓝色醌亚胺为空白, 仅以第2步产生的蓝色醌亚胺计算出肌酐的含量, 内源性肌酸不影响肌酐测定。如图2、3和表1所示, 一步酶法内源性肌酸和肌酐水解生成的肌酸同时转化为醌亚胺, 因此测定结果为肌酐和肌酸之和, 而本法肌酸和肌酐水解生成的肌酸先后转化为醌亚胺, 故可测出肌酐含量, 而与一步酶法有明显差异(P< 0.01), 与HPLC法呈高度相关(Y二步酶法=1.042XHPLC法-0.182 1, r2=0.982 4)。

在Trinder反应中, 早期使用4-氯酚, 由于其敏感性不如2, 4-二氯酚而被代替和4-AAP结合, 现在已有苯酚的衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐等30多种色原物质[4]。试验发现, 在无4-AAP存在的情况下, POD将H2O2和酚的衍生物转化为酚的二聚体, 而且当[phenol]> 10[4-AAP]的浓度时, 酚类自由基的自聚合作用将明显> 与 4- AAP 的偶联作用。因此, 在Trinder反应中, [phenol] 约为1~3[4-AAP][5, 6] 。文献[7]报道在以HDAOS为色原物的Trinder反应中, 生成蓝色醌亚胺的最大吸收波长为592 nm, 37 ℃ 8 min能够达到反应终点, 生成物稳定至少120 min。二步酶法采用HDAOS为色原物, 由于形成蓝色醌亚胺, 其测定波长为600 nm, 避开了脂血、黄疸、溶血等光谱吸收, 增加了反应信号和噪音的比值, 提高了测定的准确性, 因此降低了内源性干扰。

二步酶法具有选择性好、敏感性高、测定简便、抗干扰能力强等优点, 可用于血、尿肌酐检测, 可满足不同层次的临床实验室需要, 适合临床推广应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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