血清葡萄糖氧化酶法新色原物的实验研究

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王宝占, 李立和, 魏志斌, 刘冰. 血清葡萄糖氧化酶法新色原物的实验研究. 2012, 27(10): 799-802
WANG Baozhan, LI Lihe, WEI Zhibin, LIU Bing. Study on a new chromogenic substrate in detection of glucose in serum by glucose oxidase. Labratory Medicine, 2012, 27(10): 799-802 复制到剪切板

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《检验医学》编辑部

血清葡萄糖氧化酶法新色原物的实验研究

王宝占¹, 李立和¹, 魏志斌², 刘冰²

1.天津医科大学宝坻临床学院检验科,天津 301800

2.天津医科大学检验学院,天津 300203

作者简介:王宝占,男,1973年生,学士,主管技师,主要从事临床生物化学方法学研究。

摘要

目的

以N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)为新色原物,建立新的葡萄糖氧化酶(GOD)法检测血清葡萄糖。

方法

用HDAOS代替4-氯酚生成蓝色醌亚胺,测定波长为600 nm。采用本法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林-酚(GOD-PAP)法及高效液相色谱(HPLC)法同时测定脂血、溶血、黄疸及外观正常的血清各24份并比较结果,同时对本法进行方法学评价。

结果

在测定外观正常血清时,3种方法之间差异均无统计学意义( P>0.05);在测定脂血、溶血、黄疸血清时,本法葡萄糖测定结果与GOD-PAP法比较,差异有统计学意义( P<0.05);与HPLC法比较,差异无统计学意义( P>0.05)。本法批内、批间变异系数( CV)均<3.0%;与HPLC法呈良好相关性( r²=0.995 8);在5 min内均可达到反应终点;线性范围为0.20~28.00 mmol/L;血红蛋白<2.0 g/L、乳糜<2.2%、总胆红素<200 μmol/L对本法的干扰误差<3%;参考范围为4.10~6.20 mmol/L(男)、4.04~6.15 mmol/L(女);最大吸收波长为595 nm。

结论

以HDAOS代替4-氯酚生成蓝色醌亚胺,能通过降低脂血、溶血、黄疸光谱吸收的方法消除脂血、溶血和黄疸的干扰,提高GOD法测定葡萄糖的准确性,其使用方法与原有GOD终点法相同。

关键词: 葡萄糖; 葡萄糖氧化酶法; N-(2-羟基-3-磺丙基)-3; 5-二甲氧基苯胺钠盐

中图分类号:Q532 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)10-0799-04

Study on a new chromogenic substrate in detection of glucose in serum by glucose oxidase

WANG Baozhan¹, LI Lihe¹, WEI Zhibin², LIU Bing²

1. Department of Clinical Laboratory,Baodi Clinical Institute,Tianjin Medical University,Tianjin 301800,China

2. Institute of Laboratory Medicine, Tianjin Medical University, Tianjin 300203, China

Abstract

Objective

To establish the glucose oxidase (GOD) method using a new chromogenic substrate N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium salt (HDAOS) monohydrate in the detection of glucose in serum.

Methods

The tetrachlorophenol was replaced by HDAOS, the blue quinone-imine was formed, and it was measured at 600 nm. The GOD method, glucose oxidase-peroxidase-4-aminoantipyrene-phenol (GOD-PAP) and high performance liquid chromatography (HPLC) were used to determine serum hyper lipidemia samples (24 samples), haemolysis samples (24 samples), choloplania samples (24 samples) and normal samples (24 samples), and the results were compared. The methodology evaluation was performed.

Results

There was no statistical significance among the 3 methods, when the normal serum group was measured ( P>0.05). Statistical significance only existed between the GOD method and GOD-PAP, when the serum groups of hyperlipidemia, hemolysis and choloplania were measured ( P<0.05), and there was no statistical significance between the GOD method and HPLC ( P>0.05). The between-run and within-run coefficients of variation ( CV) were<0.3%. The GOD method had a good correlation with HPLC ( r²=0.995 8), and got to the reaction end point within 5 min. The linear range was 0.20-28.00 mmol/L. When hemoglobin <2.0 g/L, chyle<2.2% and total bilirubin <200 μmol/L, the interference error for the GOD method was <3%. The reference values were 4.10-6.20 mmol/L for males and 4.04-6.15 mmol/L for females,and the maximal absorbing wavelength was 595 nm.

Conclusions

Replacing tetrachlorophenol with HDAOS, the blue quinone-imine is formed. The GOD method eliminates the interference of hyperlipidemia,haemolysis and choloplania through limiting their absorption spectra. The GOD method has a good measurement accuracy in the detection of glucose and performs the same reaction end point.

Keyword: Glucose; Glucose oxidase method; N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3; 5-dimethoxyaniline sodium salt

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临床实验室常用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林-酚(GOD-PAP)法测定血清葡萄糖, 测定波长为510 nm, 但此法易受脂血、黄疸、溶血的干扰而造成或高或低的影响。因此, 我们开展了以N-(2-羟基-3-磺丙基)-3, 5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)为新色原物的方法学研究。

材料和方法

一、样本来源

选取天津医科大学宝坻临床学院门诊、住院患者外观正常血清42份、黄疸血清24份、脂血血清24份、溶血血清24份。

二、仪器与试剂

配制每升磷酸盐缓冲液(PBS)中含HDAOS 1.0 mmol、4-氨基安替比林(4-AAP)2.0 mmol、抗坏血酸氧化酶20 kU、葡萄糖氧化酶(GOD)1.5 kU、过氧化物酶(POD)1.5 kU、变旋酶2 kU、Proclin-300 200 μ L。血红蛋白、乳糜、黄疸标准干扰物质购自日本SYSMEX公司。测定仪器为日本OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪。

三、方法

本法测定条件为样本∶ 试剂=1∶ 100、温度37 ℃、反应时间8.1 min、主波长600 nm、副波长700 nm、终点法比色测定。GOD-PAP法采用北京利德曼生化股份有限公司试剂, 测定条件为样本∶ 试剂=1∶ 100、温度37 ℃、反应时间8.1 min、主波长510 nm、副波长700 nm、终点法比色测定。2种方法均采用北京利德曼生化股份有限公司标准液进行定标。高效液相色谱(HPLC)法采用卫生部老年医学研究所葡萄糖测定方法。

四、测定原理

GOD-PAP法反应公式:

β -D-葡萄糖+H₂O+O₂ D-葡萄糖+H₂O₂ (1)

H₂O₂+4-AAP+苯酚红色醌亚胺+2H₂O+HCl (2)

本法反应公式:

β -D-葡萄糖+H₂O+O₂ D-葡萄糖+H₂O₂ (3)

H₂O₂+4-AAP+HDAOS 蓝色醌亚胺+2H₂O+HCl (4)

五、脂血、溶血和黄疸血清在不同波长下的吸收光谱图

见图1。

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	图1 脂血、溶血和黄疸血清的吸收光谱

六、统计学方法

应用NOSA V2.3统计软件进行分析。数据采用 $\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ ± s表示, 组间比较采用配对t检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、精密度试验

取高、中、低3份不同葡萄糖浓度的混合血清, 用本法测定。批内精密度和批间精密度见表1。

表1 高、中、低不同浓度的血清葡萄糖精密度比较

样本号	例数	批内精密度		批间精密度
样本号	例数	$\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ ± s (mmol/L)	CV(%)	$\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ ± s (mmol/L)	CV(%)
1	20	2.55± 1.44	2.15	2.54± 1.66	2.56
2	20	5.81± 5.47	1.54	2.84± 5.93	1.67
3	20	20.25± 4.86	0.65	21.02± 5.93	0.79

注:CV为变异系数

表1 高、中、低不同浓度的血清葡萄糖精密度比较

二、准确性评价

在0.20~27.80 mmol/L范围内本法血清葡萄糖测定结果与HPLC法比较差异无统计学意义(t=0.541 6, P> 0.05, n=42), 呈良好相关性, 回归方程为Y_本法=1.021X_HPLC法-0.243 2, r²=0.995 8, 见图2。

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	图2 本法与HPLC法测定值回归曲线

三、本法测定血清葡萄糖的吸收光谱曲线

吸收光谱以试剂空白为参比, 在UV-2201紫外分光光度计上扫描, 测得标准管、测定管二者最大吸收波长均在595 nm处。OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪无595 nm波长, 因此选用靠近595 nm的600 nm为主波长, 同时选用700 nm为副波长, 以减少血清本身颜色等对A值的影响, 见图3。

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	图3 本法吸收光谱图

四、实时反应曲线

选葡萄糖含量为5.80、12.54、25.40 mmol/L的样本, 均在5 min内到达反应终点, 见图4。

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	图4 不同葡萄糖浓度实时反应曲线（注:每个测定点相当于0.3 min）

五、线性范围

取一葡萄糖低值、高值质控血清, 分别稀释为1/7、2/7、3/7、4/7、5/7、6/7、7/7, 其测定值最大值即为线性范围。本法的线性范围为0.20~28.00 mmol/L, 见图5。

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	图5 本法线性范围

六、脂血、溶血、黄疸对本法测定的干扰

取双份混合血清, 其中一份分别加入不同浓度的血红蛋白(Hb)、乳糜、黄疸[总胆红素(TBil)]标准干扰物质, 应用本法测定葡萄糖, 并与不加干扰物的混合血清比较。Hb< 2.0 g/L、脂血< 2.2%、TBil< 200 μ mol/L对本法的干扰误差< 3%, 见表2。

表2 Hb、乳糜、TBil对3种血糖测定方法的干扰比较(

\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}

± s, mmol/L)

组别	例数	本法	GOD-PAP法	HPLC法
乳糜(%)	24
1.1		4.68± 1.82	4.70± 1.94	4.68± 1.80
2.2		4.74± 1.84	4.76± 2.01^*	4.70± 1.82
4.4		4.81± 1.94^*	5.52± 2.44^*	4.71± 1.83
Hb(g/L)	24
0.5		4.59± 1.53	4.63± 1.52	4.63± 1.49
1.0		4.62± 1.60	4.64± 1.54^*	4.64± 1.54
2.0		4.74± 1.64	4.79± 1.82^*	4.66± 1.55
TBil(μ mol/L)	24
50		4.60± 1.51	4.63± 1.71	4.60± 1.50
100		4.61± 1.52	4.50± 1.68^*	4.62± 1.51
200		4.63± 1.54	4.32± 1.62^*	4.64± 1.52
外观正常血清	24	4.65± 1.37	4.67± 1.66	4.66± 1.36

注:与外观正常血清比较, * P< 0.05

表2 Hb、乳糜、TBil对3种血糖测定方法的干扰比较(

\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}

± s, mmol/L)

采用3种方法同时测定脂血、溶血、黄疸和外观正常血清各24份。在测定外观正常血清时, 3种方法之间差异无统计学意义(P> 0.05)。在测定脂血、溶血、黄疸血清时本法与GOD-PAP法比较, 差异有统计学意义(P< 0.05); 与HPLC法比较, 差异无统计学意义(P> 0.05), 见表3。

表3 3种方法测定待检者血清血糖结果比较(mmol/L)

七、本法参考范围

选择120名体检合格成年人, 男65名, 女55名, 年龄18~60岁。空腹静脉采血, 用本法测定血清葡萄糖。参考范围( $\begin{matrix} \overset{̅}{x} \end{matrix}$ ± 2s)分别为:4.10~6.20 mmol/L(男)、4.04~6.15 mmol/L(女)。

八、方法学评价

在Trinder反应中, 试验发现, 在无4-AAP存在的情况下, POD将H₂O₂和酚的衍生物转化为酚的二聚体, 而且当[phenol] > 10[4-AAP] 的浓度时, 酚类自由基的自聚合作用将明显大于与4-AAP的偶联作用。因此, 在Trinder反应中, [phenol] 约为1~3[4-AAP]^{[1, 2]} 。有文献报道, 在以N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3, 5-二甲氧基苯胺钠盐为色原物的Trinder反应中, 生成蓝色醌亚胺的最大吸收波长为595 nm, 37 ℃ 5 min能够达到反应终点, 生成物稳定至少120 min^[3]。应用本法每天测定室内质控定值血清[低(2.80 mmol/L)、中(6.30 mmol/L)、高(15.20 mmol/L)], 应用LIS系统统计(n=180 d), 其日间总CV分别为2.67%、2.24%、2.52%。说明该试剂至少能稳定6个月。空白A值< 0.05 ABS(0.5 cm光径、600 nm、37 ℃), 开瓶后试剂能稳定2 d, 在OLYMPUS AU2700全自动生化分析仪上0.032Δ A/min相当于1.0 mmol/L葡萄糖。

讨论

本法批内、批间CV均< 3.0%; 与HPLC法呈良好相关性(r²=0.995 8); 在5 min内均可达到反应终点; 线性范围为0.20~28.00 mmol/L; 参考范围为4.10~6.20 mmol/L(男)、4.04~6.15 mmol/L(女); 最大吸收波长为595 nm, 在此波长下, 溶血、黄疸、脂血样本A值均很低。因此, 本法测定脂血、黄疸、溶血血清的结果与HPLC法无明显差异。HPLC法测定葡萄糖不受内源性脂血、黄疸、溶血的干扰, 结果可靠, 有望作为葡萄糖测定的参考方法。本研究中GOD-PAP法在测定脂血、黄疸、溶血血清时与HPLC法有明显差异, 溶血、脂血产生正干扰, 黄疸产生负干扰, 这与文献报道相一致。本法与HPLC法无明显差异, 结果可靠, 由于改变了光谱吸收, 黄疸和溶血几乎不影响光谱吸收。本研究采用HDAOS为色原物, 由于形成蓝色醌亚胺, 其测定波长为600 nm, 在脂血、黄疸、溶血等光谱吸收远低于510 nm红色醌亚胺的光谱吸收。增加了反应信号和噪音的比值, 提高了测定的准确性, 因此, 降低了内源性干扰。脂血、黄疸、溶血等对血清葡萄糖的测定影响主要是光谱吸收, 当血清指数(LIH)较大时, 会超过仪器设置的样本限, 仪器会报警提示可能对结果造成影响, 测定反应的光谱吸收远低于LIH的光谱吸收, 测定信号被“ 淹没” , 光谱信号的微小变化对测定结果产生较大波动。因此, 当LIH高时, 最好不予测定。

现在已使有苯酚的衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐等30多种色原物质, 对苯酚、2, 4 -二氯苯酚、2, 6 -二氯苯酚及间-苯二酚等4种苯原酚化合物作为POD催化4-AAP-过氧化氢-酚显色体系(Trinder)进行比较研究。结果表明, 苯酚、2, 4-二氯苯酚及间-苯二酚3种苯原酚分别构成 GOD-POD-4-AAP-H₂O₂-酚显色体系测定时, 其检测结果均差异无统计学意义( P> 0.05), 但 2, 4 -二氯苯酚显色体系的显色敏感性、方法的精密度和准确性均优于苯酚显色体系, 间-苯二酚显色体系敏感性不及苯酚, 但检测速度快, 线性范围宽, 可用于较高浓度溶液的在线快速分析^[4]。

本研究采用新的酚衍生物HDAOS为Tinder反应的色源, 显色反应的敏感性高, 且生成的醌亚胺染料最大波长为595 nm, 脂血、溶血、黄疸引起的干扰明显减小, 各项方法学指标满足临床实际应用需要, 具有选择性好、敏感性高、测定简便等特点, 适合临床推广应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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研究了辣根过氧化物酶(HRP)/H2O2体系中苯酚与4-氨基安替比林(4-AAP)的偶合反应.在pH 8.0的条件下,产物在494.0 nm处有最大吸收,线性范围为(4.3×10-6～2.6×10-4)mol/L(R2=0.9993),检出限为4.75×10-7mol/L,相对标准偏差为3.7%(n=9).动力学方面,用孤立法研究了各反应物对反应速率的影响,得到4-AAP、H2O2和phenol的反应级数分别为0、1.3和0.7,据此建立了反应速率方程式,求得活化能为42.09 kJ/mol,并推测出反应的可能机理.

... 因此,在Trinder反应中,[phenol] 约为1~3[4-AAP]^[1,2] ...

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0.0

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酚类化合物酶处理反应机理初探

黄慧, 赵庆祥, 张彤

研究了辣根过氧化物酶处理酚和氯酚的反应机理和动力学特征。根据酶反应动力学特征判断辣根过氧化物酶催化酚和氯酚氧化耦合反应属于乒乓双双反应机制。阐明了Ｈ２Ｏ２抑制机理，测定了酶反应中Ｈ２Ｏ２抑制的动力学参数。通过测定不同底物酶反应的动力学参数，比较了取代基数目及取代位置对酶反应的影响。

... 因此,在Trinder反应中,[phenol] 约为1~3[4-AAP]^[1,2] ...

2003

0.0

... 有文献报道,在以N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐为色原物的Trinder反应中,生成蓝色醌亚胺的最大吸收波长为595 nm,37 ℃ 5 min能够达到反应终点,生成物稳定至少120 min^[3] ...

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对苯酚、2,4-二氯苯酚、2,6-二氯苯酚及间-苯二酚等四种苯原酚化合物作为过氧化物酶(POD)催化4-氨基安替比林(4-AA)-过氧化氢-酚显色体系测定血糖的葡萄糖氧化酶法(GOD-Trinder)进行比较研究.结果表明,苯酚、2,4-二氯苯酚及间-苯二酚三种苯原酚分别构成GOD-POD-4-AA-H2O2-酚显色体系测定血糖时,其检测结果均无显著性差异(P＞0.05),但2,4-二氯苯酚显色体系的显色灵敏度、方法的精密度和准确度均优于苯酚显色体系.间-苯二酚显色体系灵敏度不及苯酚,但检测速度快,线性范围宽,可用于较高浓度葡萄糖溶液的在线快速分析.

... 05),但 2,4 -二氯苯酚显色体系的显色敏感性、方法的精密度和准确性均优于苯酚显色体系,间-苯二酚显色体系敏感性不及苯酚,但检测速度快,线性范围宽,可用于较高浓度溶液的在线快速分析^[4] ...