引用本文
韩建华, 苏薇, 文艳, 崔巍, 邱玲. 单纯性肥胖者血清胆汁酸谱研究. 2012, 27(10): 795-798
HAN Jianhua, SU Wei, WEN Yan, CUI Wei, QIU Ling. Research of serum bile acid profiles in patients with simple obesity. Labratory Medicine, 2012, 27(10): 795-798  
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《检验医学》编辑部
单纯性肥胖者血清胆汁酸谱研究
韩建华1, 苏薇1, 文艳2, 崔巍1, 邱玲1
1. 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院检验科,北京 100730
2. 岛津企业管理(中国)有限公司,北京 100020

作者简介:韩建华,女,1980年生,硕士,实习研究员,主要从事临床生化和免疫学检验研究。

通讯作者:邱玲,联系电话:010-69155420。

摘要
目的

探讨单纯性肥胖者血清胆汁酸谱的特征,为阐明胆汁酸引发的能量代谢相关机制和探寻新的肥胖生物治疗靶点提供研究依据。

方法

利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用方法检测体检人群中10名表观正常对照者、10例超重者和10例单纯性肥胖者血清胆汁酸谱的特征。

结果

表观正常对照组、超重组和单纯性肥胖组血清中14种胆汁酸亚组分均有表达,其中的石胆酸(LCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺石胆酸(TLCA)和牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)的表达水平最低;14种胆汁酸亚组分在各组间的差异均无统计学意义( P>0.05);单纯性肥胖组的胆汁酸谱中以甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)增高为主;超重组及单纯性肥胖组血清游离型胆汁酸(FBA)和结合胆汁酸(CBA)水平稍低于表观正常对照组,但差异无统计学意义( P>0.05)。

结论

单纯性肥胖者血清胆汁酸谱中以GCDCA和TCDCA增高为主,但各种胆汁酸亚组分的表达水平与表观正常者相同。

关键词: 胆汁酸谱; 单纯性肥胖; 超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号:Q548 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)10-0795-04
Research of serum bile acid profiles in patients with simple obesity
HAN Jianhua1, SU Wei1, WEN Yan2, CUI Wei1, QIU Ling1
1. Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China
2.Shimadzu Business Management (China) Co., Ltd., Beijing 100020, China
Abstract
Objective

To investigate the expression characteristics of serum bile acid profiles in patients with simple obesity, further to understand the effect of bile acids inducing signaling on human body energy metabolism, and to provide experimental evidence and clues on searching potential biotherapy target.

Methods

Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) assay was used to test serum bile acid profiles of 10 healthy subjects, 10 subjects with overweight and 10 patients with simple obesity.

Results

A total of 14 bile acid subgroups were detected in all sera from healthy, overweight and simple obesity groups, and lithocholic acid (LCA),taurocholic acid (TCA), taurolithocholic acid (TLCA) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) had lowest expression in all groups. The expressions of all different 14 bile acid subgroups had no statistical significance( P>0.05). The levels of glycochenodeoxycholic acid (GCDCA) and taurochenodeoxycholic acid (TCDCA) increased markedly in serum bile acid (FBA) profiles of simple obesity group. Both free bile acids (CBA) and conjugated bile acids from overweight and simple obesity groups were lower than those from healthy group ( P>0.05).

Conclusions

The levels of GCDCA and TCDCA increase markedly in serum bile acid profiles of patients with simple obesity, but the expressions of all different 14 bile acid subgroups have no significant difference with those of healthy subjects.

Keyword: Bile acid profile; Simple obesity; Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

胆汁酸是在肝细胞内合成的一类内源性羟基衍生物, 主要在脂质的消化和吸收中发挥作用, 正常人体内的胆汁酸按结构可分为2大类:一类为游离型胆汁酸(FBA), 包括胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)和少量的熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA); 另一类是上述FBA与甘氨酸(G-)或牛磺酸(T-)结合的产物。新近的研究表明, 胆汁酸还可以作为信号分子, 在人体脂质、葡萄糖以及能量代谢过程中发挥重要的调节作用[1]。因此, 研究由于能量代谢失衡引起的单纯性肥胖者体内的胆汁酸表达特征谱, 将有助于阐明胆汁酸引发的能量代谢相关机制, 并为治疗肥胖探寻新的生物靶点。

采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)研究人体内血清胆汁酸谱。该方法无须对样本进行衍生化, 优于普通液相色谱方法[2]; 比传统的液相色谱-串联质谱联用方法测定时间更短[3], 分辨率更高。且在提高检测敏感性的同时, 减少了进样体积, 加快了出峰时间, 降低了溶剂消耗, 使样本的分析检测更加高效、更加环保。我们运用UPLC-MS/MS方法同时检测健康体检人群中表观正常对照者、超重者与单纯性肥胖者血清胆汁酸谱, 希望探讨胆汁酸各亚组分在单纯性肥胖者体内参与能量代谢的作用机制, 为进一步的研究提供基础支持。

材料和方法
一、 研究对象

选取北京协和医院体检中心30名健康体检者, 既往无任何病史, B超、影像学和血液学指标均无异常, 男18名, 女12名, 年龄21~39岁。参照《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》[4]定义, 将30名体检者分为表观正常对照组10名[体重指数(BMI)为18.5~23.9 kg/m2], 超重组10例(BMI为24.0~27.9 kg/m2), 单纯性肥胖组10例(BMI≥ 28.0 kg/m2)。

二、 研究方法
1. 样本收集

所有受检者均隔夜空腹8 h以上, 清晨抽静脉血3.5 mL, 离心分离血清, -20 ℃保存, 用于胆汁酸亚组分检测。

2. 样本分析前的处理

样本置室温30 min复融, 涡旋振荡30 s, 用固相萃取法去除样本中的蛋白和脂质干扰物。将固相萃取小柱依次用1 mL甲醇、1 mL 0.5%甲酸溶液活化, 将300 μ L血清加到1 mL 0.5%甲酸溶液中, 混匀1 min, 加入固相萃取小柱中, 用1 mL 10%甲醇冲洗, 用1 mL 100%甲醇进行洗脱(所有步骤均让溶液在重力作用下自行滴干), 洗脱液过0.2 μ m滤膜后装入上样小瓶进行检测, 进样体积为10 μ L。

三、 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC/XEVO TQ MS, 美国Waters公司); ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm× 50 mm, 1.8 μ m, 美国Waters公司); OASIS HLB 固相萃取小柱(1CC 30 mg, 美国Waters公司); GHP ACRODISC滤膜(13 mm, 0.2 μ m, 美国Waters公司); Millpore纯水装置(美国Millpore公司); 14种胆汁酸[CA、DCA、CDCA、UDCA、LCA、甘氨胆酸(GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)]标准品和醋酸铵均为HPLC级(美国Sigma-Aldrich公司); HPLC级甲酸(美国MOREDA公司); HPLC级甲醇(美国Fisher公司)。

四、质谱条件和色谱条件

质谱条件参考文献[5]并根据仪器特性进行优化。离子化模式:ESI-; 喷雾电压:2.40 kV; 离子源温度:150 ℃; 雾化气温度:450 ℃; 流速:900 L/h。色谱条件参考文献[3]确定。流动相A为5 mmol/L醋酸铵+0.01%甲酸水溶液; 流动相B为5 mmol/L醋酸铵+0.01%甲酸甲醇溶液, 梯度洗脱程序:0 min(50%A)→ 0.5 min(35%A)→ 2.0 min(28.5%A)→ 2.2 min(26.0%A)→ 3.0 min(20%A)→ 3.5 min(1%A)→ 4.0 min(50%A)→ 4.5 min(50%A)。

五、统计学方法

数据采用Excel 2003和SPSS 13.0等软件进行分析, 采用Shapiro-wilk进行数据的正态性检验, 采用中位数(四分位数间距)描述结果, 对于符合正态分布的数据采用t检验或方差分析(one-way ANOVA)进行统计, 对于不符合正态分布的采用Kruskal-Wallis H检验进行多组间比较, Nemenyi法进行组间两两比较, 各数据之间的相关性采用Spearman相关分析。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、表观正常对照组、超重组和单纯性肥胖组血清胆汁酸谱结果

各组血清14种胆汁酸亚组分均有表达, 其中以LCA、TCA、TLCA和TUDCA的表达水平最低, 14种胆汁酸亚组分在各组间的表达差异无统计学意义(P> 0.05); 而单纯性肥胖组的胆汁酸谱中以GCDCA和TCDCA增高为主, 见表1。从图1的不同胆汁酸亚型质谱图中可以大致看出:牛磺结合胆汁酸、甘氨结合胆汁酸和FBA在3组人群中存在一定差异, 尤其以牛磺结合胆汁酸峰响应度的差异最大。

图1 表观正常对照组、超重组及单纯性肥胖组血清胆汁酸亚组分特征性质谱图注:横坐标表示保留时间, 纵坐标分别表示牛磺结合胆汁酸、甘氨结合胆汁酸和FBA的峰响应度; a图为表观正常对照组; b图为超重组; c图为单纯性肥胖组

表1 表观正常对照组、超重组及单纯性肥胖组胆汁酸亚组分浓度
二、表观正常对照组、超重组及单纯性肥胖组总胆汁酸(TBA)、FBA和结合胆汁酸(CBA)浓度分析

将3组胆汁酸亚组分分别按照TBA、FBA(包括CA、DCA、CDCA、UDCA、LCA)及CBA(包括甘氨结合胆汁酸和牛磺结合胆汁酸)浓度进行统计分析, 结果见图2。超重组以及单纯性肥胖组血清中的FBA和CBA水平稍低于表观正常对照组, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。

图2 表观正常对照组、超重组和单纯性肥胖组患者血清中TBA、FBA和CBA浓度分析

讨论

肥胖已经成为21世纪最严重的公共健康问题之一, 目前大家一致认同:人体肥胖的发生是由于机体能量代谢的失衡所致, 而对于肥胖患者体内能量代谢障碍的研究正成为肥胖相关研究的热点。2006年Watanabe等[6]报道, 胆汁酸可以通过与细胞表面的G蛋白偶联受体家族的新成员TGR5特异性结合, 提高细胞内的2型脱碘酶活性, 促使甲状腺素(T4)转化为机体能量调节主要的内源活性物质三碘甲状腺原氨酸(T3), T3又可通过作用于多种细胞及器官, 加速机体能量的代谢以及脂肪的消耗, 从而抑制体重的增加。

虽然在不同疾病状态或代谢异常情况下, 体内胆汁酸的种类和含量会有所改变, 例如肝脏实质细胞损害时, CA/CDCA比值< 1.0; 阻塞性黄疸时CA/CDCA比值> 1.0; 妊娠肝内胆汁淤积症患者GCA和GCDCA有所增高。但实际工作中由

于对胆汁酸亚组分的检测比较困难, 使这些指标的检测很少应用于临床常规。新研究的发现使胆汁酸的研究进展到细胞水平, 为其参与体内能量代谢的机制提出新的挑战。因此, 分离并准确定量血清中FBA和CBA显得愈发重要。

本研究利用UPLC-MS/MS方法进行血清胆汁酸谱分析, 其结果表现出以下特征:14种胆汁酸亚组分在各组间的表达差异无统计学意义(P> 0.05), 超重组以及单纯性肥胖组血清TBA、FBA和CBA水平稍低于表观正常对照组, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。

纵观整个结果, 虽然3组间血清胆汁酸谱存在趋势性改变, 但各胆汁酸亚组分间的差异无统计学意义, 这可能与本研究纳入的受检者较少有关。进一步的研究中增大样本量, 将有助于探寻单纯性肥胖者的胆汁酸谱表达特征, 为寻找单纯性肥胖者体内介导胆汁酸引发的能量代谢研究提供方法学依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 韩建华, 邱玲. 胆汁酸代谢的研究进展[J]. 国际检验医学杂志, 2007, 28(9): 824-825. [本文引用:1]
[2] 丁敏, 刘春芳, 何俊. 柱前衍生反相高效液相色谱法测定血清中9种胆汁酸[J]. 分析科学学报, 2004, 20(5): 492-494. [本文引用:1]
[3] 丁敏, 叶炼, 王猛, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合胆汁酸[J]. 分析化学研究简报, 2007, 35(10 ): 1506-1508. [本文引用:1]
[4] 中华人民共和国卫生部疾病控制司. 中国成人超重和肥胖症预防控制指南[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 1-4. [本文引用:1]
[5] Burkard I, Von Eckarstein A, Rentsch KM. Differentiated quantification of human bile acids in serum by high-performance liquid chromatography-tand em mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Bio-med Life Sci, 2005, 826(1-2): 147-159. [本文引用:1]
[6] Watanabe M, Houten SM, Mataki C, et al. Bile acids induce energy expenditure by promoting intracellular thyroid hormone activation[J]. Nature, 2006, 439(7075): 484-489. [本文引用:1]