引用本文
陈建伟, 张晓霞, 崔云. 双尾彗星实验检测精子DNA完整性的方法学建立. 2012, 27(1): 21-25
CHEN Jianwei, ZHANG Xiaoxia, CUI Yun. Methodology establishment of two-tailed comet assay for sperm DNA integrity detection. Labratory Medicine, 2012, 27(1): 21-25  
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《检验医学》编辑部
双尾彗星实验检测精子DNA完整性的方法学建立
陈建伟1, 张晓霞1, 崔云2
1. 宁波市中医院检验科,浙江 宁波 315012
2.宁波市中医院男科,浙江 宁波 315012

作者简介：陈建伟,男,1969年生,学士,副主任技师,主要从事医学检验工作。

基金:浙江省中医药科技计划项目(2010ZA110); 宁波市科技局农发创新基金项目(2010C9104);
摘要
目的

建立双尾彗星实验检测精子DNA完整性的方法学,并分析精子DNA损伤的类型。

方法

利用中性和碱性双相单细胞凝胶电泳技术检测精子DNA损伤的情况。

结果

双尾彗星实验共得到9种彗星形态,分别代表9种精子DNA损伤类型。利用H2O2和限制性内切酶AluI分别诱导单链DNA和双链DNA的产生。随着H2O2浓度逐渐增加,单链DNA的断裂逐渐增多,显微镜下可见含Y轴彗星尾的精子数逐渐增多,差异有统计学意义(P<0.05)。同样,随着AluI消化时间的延长,双链DNA的断裂增多,显微镜下可见含X轴彗星尾的精子数增多,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,我们还发现男性不育组和有正常生育能力组的DNA单链损伤碎片指数(SSB-DFI)差异无统计学意义,而男性不育组的DNA双链损伤碎片指数(DSB-DFI)却显著高于正常生育能力组(P<0.05)。

结论

双尾彗星实验能够区分精子DNA损伤是单链损伤还是双链损伤,为评估男性的生育能力提供更加深入、有力的实验室依据。

关键词: 双尾彗星实验; SSB; DSB; 男性不育
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)01-21-05
Methodology establishment of two-tailed comet assay for sperm DNA integrity detection
CHEN Jianwei1, ZHANG Xiaoxia1, CUI Yun2
1.Department of Clinical Laboratory, Ningbo Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhejiang Ningbo 315012, China
2.Male Department, Ningbo Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhejiang Ningbo 315012,China
Abstract
Objective

To establish two-tailed comet assay methodology for sperm DNA integrity detection and analyze the type of sperm DNA damage.

Methods

The neutral and alkaline two-phase single cell gel electrophoresis was used to detect sperm DNA damage.

Results

After the two-tailed comet assay, 9 kinds of comet forms were obtained, which representing the 9 kinds of sperm DNA damage types. H2O2 and AluI restriction endonucleases were used to induce single-strand DNA and double-strand DNA productions. With the increasing concentration of H2O2, the single-strand DNA breaks gradually increased. By the microscopy, the number of comet tail in Y axis gradually increased, and the difference was statistically significant(P<0.05). With AluI digestion time extending, the double-strand DNA breaks increased. By the microscopy, the number of comet tail in X axis increased, and the difference was statistically significant (P<0.05). In addition, the single-strand break DNA fragmentation indices (SSB-DFI) in male infertility group and normal fertility group had no significant difference. The double-strand break DNA fragmentation index (DSB-DFI) in male infertility group was significantly higher than that in normal fertility group (P<0.05).

Conclusions

Two-tailed comet assay could distinguish sperm DNA damage which is single-strand break or double-strand break, and it maybe provide a deeper and stronger laboratory evidence for male fertility.

Keyword: Two-tailed comet assay; Single-strand break; Double-strand break; Male infertility
引言

男性不育是目前关注较多的医学难题,其发病机理较复杂,可能与自身、环境等多种因素有关。研究发现,不育男性精子DNA完整性明显低于有生育能力的男性。精子DNA的完整性对生育能力、人工受精、胚胎发育、婴儿成长等密切相关,已成为体外辅助生殖技术成功与否的一项十分有意义的检测指标[ 1, 2]。一些学者认为精子DNA双链损伤与男性不育的相关性高于精子DNA单链损伤。他们认为单链DNA损伤能够快速修复,并不会造成染色质结构异常及遗传物质的丢失,因此对生育能力的影响较小。目前检测精子DNA完整性的方法较多,有精子染色质结构分析(SCSA)、单细胞凝胶电泳(comet assay)、精子染色体扩散实验(SCD)、荧光原位杂交技术(FISH)、末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)等[ 3]。但是,这些检测方法都存在一个共同的缺点,就是不能分辨出DNA损伤的类型。因此,我们建立了中性和碱性双向的单细胞凝胶电泳技术(双尾彗星实验)来检测精子DNA的完整性,并进一步鉴别精子DNA的损伤类型。这一方法对于明确精子DNA的损伤类型及对于男性生育能力的评估、治疗及预后判断有重要的参考意义。

材料和方法
一、实验对象

选择15例少、弱或畸形精子症的男性不育患者,年龄2435岁;将15名已生育过的男性志愿者列为对照组,年龄2838岁,并且无泌尿生殖道疾病者。所有实验对象均知情同意。

二、试剂与仪器

BX41型荧光显微镜(日本Olympus公司);DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂);PHS-3C实验室pH计(上海鹏顺科学仪器有限公司);SYBR Green I(厦门百维信生物科技有限公司);其他试剂均为国产试剂。

三、双尾彗星实验

用PBS缓冲液将精子密度稀释到10×106/mL;取25 μL精液与50 μL新鲜配制的1%低熔点琼脂糖凝胶(去离子水配制)在37 ℃下混匀。取15 μL(盖玻片面积18 mm×18 mm)上述混合物加在预先准备好的凝胶玻片上,盖上盖玻片,置4 ℃冰箱5 min,使其迅速凝固。待胶凝固,小心滑掉盖玻片,将玻片浸入到预冷的新鲜配制的裂解液1[0.4 mol/L Tris-HCl、0.8 mol/L二硫苏糖醇(DTT)、1%十二烷基硫酸钠(SDS),pH值7.5]中避光裂解30 min。然后,再将玻片浸入到预冷的新鲜配制的裂解液2[0.4 mol/L Tris-HCl,2 mol/L NaCl,1%SDS,0.05%乙二胺四乙酸(EDTA),pH值7.5]中避光裂解30 min。用纸巾将裂解液吸干。将玻片放入到预冷的硼酸缓冲液(TBE) buffer中避光静置10 min,使其解旋。中性凝胶电泳:把玻片浸入到盛有新鲜配制的TBE的电泳槽中,接上电源,20V、12 mA、12.5 min;用0.9%NaCl洗涤2 min;浸入预冷的碱性电泳缓冲液(1 mmol/L EDTA-Na2,300 mmol/L NaOH,pH值13)避光静置2.5 min。碱性凝胶电泳:将载玻片旋转90 ℃,12 mA,4 min;然后,将玻片放入预冷的中和缓冲液(0.4 mol/L Tris-HCl,pH值7.5)中和5 min;将玻片浸入TBE buffer 2 min;用浓度梯度增加的乙醇脱水,最后在空气中干燥。染色:用核苷酸胶体染料(SYBR Green I)和TBE1∶10 000稀释染色,避光染色30 min。

四、单链DNA断裂(single-stranded DNA breaks, SSB)的诱导

用PBS缓冲液将精子密度稀释到10×106/mL;将稀释后的标本分为4份,每份200 μL;前3份分别在0.03%、0.15%和0.3% H2O2中室温孵育30 min,另外1份不用H2O2处理作为阴性对照。后续实验步骤按照双尾彗星实验的操作步骤进行操作。

五、双链DNA断裂(double-stranded DNA breaks, DSB)的诱导

双尾彗星实验中玻片经过1 h的裂解后浸入到TBE中20 min;然后,将玻片置于50 μL的限制性内切酶AluI反应缓冲液中孵育10 min;将15 μL反应缓冲液包含15 IU AluI覆盖于玻片上,盖上盖玻片,分别在室温孵育15和25 min,同时做阴性对照。

六、CASP软件分析

采用CASP软件彗星图像分析软件,选用彗星尾的长度作为判断精子细胞损伤程度的标准。

七、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析,经H2O2和AluI处理后的组间差异采用χ2检验分析。重复性检验以 x- ±s表示。采用Mann-Whitney U-test来分析正常对照组和男性不育组的精子DNA碎片化指数。

结果
一、双尾彗星实验观察到的彗星尾的类型

双尾彗星实验中,中性凝胶电泳时彗星尾位于X轴,载玻片经90 ℃旋转后在碱性凝胶电泳时彗星尾位于Y轴。根据彗星尾的方向和长度将精子DNA的损伤类型分为9种。见 图1。

图1 双尾彗星实验中得到的精子的形态注:(a)无损伤(核清楚,尾长不超过10 μm);(b)轻度SSB(核荧光强度低,尾位于Y轴,尾长大于10 μm,不超过40 μm);(c)重度SSB(核荧光强度低或胞核与彗尾不能区分,尾位于Y轴,尾长超过40 μm);(d)轻度DSB(核荧光强度低,尾位于X轴,尾长大于10 μm,不超过40 μm);(e)重度DSB(核荧光强度低或胞核与彗尾不能区分,尾位于X轴,尾长超过40 μm);(f)轻度SSB、轻度DSB;(g)轻度SSB、重度DSB;(h)重度SSB、轻度DSB;(i)重度SSB、重度DSB;放大倍数10×10

二、经H2O2或AluI处理过的双尾彗星实验结果

利用1份弱精子症的精液标本观察经过H2O2或AluI消化处理后的精子DNA损伤情况。经H2O2处理后,SSB精子数增多,单链精子DNA碎片化指数(SSB-DFI)明显高于对照组( P<0.05)。经AluI消化后DSB精子数增多,双链精子DNA碎片指数(DSB-DFI)明显高于对照组( P<0.05)。见 表1、 图2。

表1 H2O2或AluI消化处理后的精子DNA损伤情况

图2 精子DNA损伤情况注:(a)经不同浓度的H2O2处理后的DSB-DFI、SSB-DFI;(b)经不同浓度的H2O2处理后未损伤、SSB和DSB的精子数;(c)经AluI消化后的DSB-DFI、SSB-DFI;(d)经AluI消化后,未损伤、SSB和DSB的精子数

三、双尾彗星实验的重复性检验

利用1份正常的精液标本分别进行批内和批间重复性检验,并且该检验均由同一个实验人员操作,检测100个精子。DSB-DFI的批内、批间变异系数( CV)分别为12.7%、15.0%,SSB-DFI的批内、批间 CV分别为6.9%、8.7%。见 表2。

表2 1份正常精液标本的批内、批间重复性检验
四、男性不育患者与对照组的DSB-DFI和SSB-DFI结果分析

少、弱或畸形精子症患者的精液SSB-DFI与对照组比较,差异无统计学意义( P>0.05),而DSB-DFI显著高于对照组( P<0.05)。见 表3。

表3 男性不育患者组与正常对照组的DSB-DFI和SSB-DFI结果分析 x- ±s
讨论

单细胞凝胶电泳(SCGE)又称彗星实验,是1984年由Ostling等[ 4]建立的,用于检测单个细胞的DNA损伤情况。该方法用于检测精子细胞DNA损伤已较成熟。目前的研究多是将单细胞凝胶电泳得到的DNA碎片化指数与精液常规检查的参数相结合来评价男性的生育能力[ 5, 6]。上述研究多采用碱性单细胞凝胶电泳。在碱性电泳液中,先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链,单链断裂的碎片相对分子质量小可进入凝胶中,电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移,形成拖尾。细胞DNA受损愈重,产生的断链或碱易变性断片就愈多,其断链或断片也就愈小,在电场作用下迁移的DNA量多,迁移的距离长,表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。在本研究中还增加了中性凝胶电泳,若细胞受损,在中性电泳液中,核DNA仍保持双螺旋结构,虽偶有单链断裂,但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时,其断片进入凝胶中,电泳时断片向阳极迁移,形成荧光拖尾现象,形似彗星。因此,中性SCGE可以检测DSB,碱性SCGE可以检测SSB。通过中性和碱性双向SCGE可以分辨出DNA损伤的类型是单链损伤还是双链损伤。

目前检测精子DNA完整性的方法虽较多,但是都无法分辨损伤的类型是单链断裂还是双链断裂,而损伤类型的不同对于疾病的发生可能有着很大的差别。Collins等[ 7]和Speit等[ 8]都认为SSB其双螺旋结构还存在,可以自身修复,不会造成染色质结构异常及遗传物质丢失;DSB其双螺旋结构遭到破坏,很难再修复。因此DSB与男性不育可能有更加密切的关系。Enciso等[ 9]在其研究中也提到,不育男性和有生育能力的男性其SSB-DFI无明显差异,而DSB-DFI在2组间有明显差异。因此明确精子DNA的损伤类型,对男性不育的评估、治疗及预后的判断有很大的参考价值。

为了进一步证明此方法的可信性,本研究还分别用H2O2和限制性内切酶AluI分别诱导SSB和DSB的产生。随着H2O2浓度逐渐增加,单链DNA的断裂增多,荧光显微镜下观察Y轴方向彗星尾的精子数逐渐增多,X轴方向彗星尾的精子数变化不明显。同样,随着酶消化时间的延长,双链DNA的断裂增多,荧光显微镜下观察X轴方向彗星尾的精子数增多,Y轴方向彗星尾的精子数变化不明显。这些试验进一步证明了在双尾彗星实验中可以通过彗星尾的方向判断DNA的损伤类型。另外,本研究分别做了批内和批间的重复性试验来验证该方法学的重复性,DSB-DFI的批内和批间 CV分别为12.7%和15.0%。SSB-DFI的批内和批间 CV值分别为6.9%和8.7%。双尾彗星实验可以通过SSB-DFI和DSB-DFI整体评价1份标本的精子DNA损伤情况,还可以揭示单个精子DNA损伤的类型是SSB还是DSB。因此,该方法评价精子DNA的损伤情况更加准确、深入,可以为临床判断男性的生育能力提供更加丰富、有力的参考依据。

另外,在方法学的建立过程中本研究发现,SSB-DFI在男性不育组和对照组中差异无统计学意义,而男性不育组DSB-DFI却明显高于对照组。这说明双链DNA损伤可能是导致男性不育的关键因素之一,还需进一步增加样本验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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