引用本文
王春, 赵百慧, 张泓, 张曦. 上海市儿童下呼吸道感染常见病毒诊断方法比较. 2011, 26(9): 589-592
WANG Chun, ZHAO Baihui, ZHANG Hong, ZHANG Xi. Comparison on diagnostic method of children lower respiratory tract infection by common virus in Shanghai. Labratory Medicine, 2011, 26(9): 589-592  
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《检验医学》编辑部
上海市儿童下呼吸道感染常见病毒诊断方法比较
王春1, 赵百慧2, 张泓1, 张曦2
1. 上海市儿童医院 上海交通大学附属儿童医院检验科,上海 200040
2. 上海市疾病预防控制中心,上海 200336

通讯作者：赵百慧,联系电话：021-62474880-82305。

作者简介：王春,女,1973年生,主管技师,主要从事呼吸道病毒工作。

基金:上海市、区县疾病预防控制中心学科人才培养科研项目资助计划(中心2007-9); 国家“十一五”科技重大专项资助项目(2009ZX1004-211);
摘要
目的

应用直接免疫荧光法(DFA)和多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对呼吸道感染患儿鼻咽分泌物的常见病毒进行检测,比较2种方法的符合率并评估其临床应用价值。

方法

选取急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物540例,分别用DFA和多重RT-PCR进行检测,分析其结果。

结果

DFA检测阳性率为43.9%(237/540),多重RT-PCR检测阳性率为55.7%(301/540),多重RT-PCR阳性检出率显著高于DFA的阳性检出率(χ2=29.093,P<0.01)。DFA和多重RT-PCR同时阳性163例,DFA阳性而多重RT-PCR阴性74例,多重RT-PCR阳性而DFA阴性138例,DFA和多重RT-PCR同时阴性165例。DFA和多重RT-PCR同时为阳性的163例标本中,有15例标本两者检测结果不一致,符合率为91.0%。

结论

DFA快速、简便、特异性及敏感性高,适用于临床检测。多重RT-PCR的敏感性高,检测病毒谱广,且可以做亚型鉴定,适用于呼吸道病毒流行病学的调查。

关键词: 呼吸道病毒感染; 直接免疫荧光法; 多重逆转录聚合酶链反应; 儿童
中图分类号:R373 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)09-0589-04
Comparison on diagnostic method of children lower respiratory tract infection by common virus in Shanghai
WANG Chun1, ZHAO Baihui2, ZHANG Hong1, ZHANG Xi2
1.Department of Clinical Laboratory, Children's Hospital of Shanghai,Children's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040,China
2.Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336,China
Abstract
Objective

To apply direct immuno-fluorescence assay (DFA )and multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) to detect common virus in nasopharyngeal secretions, compare the coincidence rate of this 2 methods, and evaluate the clinical application value.

Methods

There were 540 samples of nasopharyngeal secretions collected from the children with respiratory tract infection. They were detected by DFA and multiplex RT-PCR, and the results were analyzed.

Results

DFA positive rate was 43.9%(237/540), and multiplex RT-PCR positive rate was 55.7%(301/540). The positive detection rate of multiplex RT-PCR was obviously higher than that of DFA(χ2=29.093,P<0.01). There were 163 cases positive for DFA and multiplex RT-PCR simultaneously, 74 cases were DFA positive and multiplex RT-PCR negative, and 138 cases were multiplex RT-PCR positive and DFA negative. There were 165 cases negative for DFA and multiplex RT-PCR simultaneously. In the 163 DFA and multiplex RT-PCR both positive samples, the results of 15 cases were inconsistent, and the coincidence rate was 91.0%.

Conclusions

DFA is rapid and simple, and it has high specificity and sensitivity. It can be used to clinical application. Multiplex RT-PCR sensitivity was slightly high, and multiplex RT-PCR can detect viruses broadly. It can be used to subgroup identification and is suitable for respiratory tract virus epidemiology research.

Keyword: Respiratory tract virus infection; Direct immuno-fluorescence assay; Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction; Child

呼吸道感染是儿童感染性疾病中最常见的疾病,其中90%由病毒引起[ 1]。近年来不断报道有新的病毒出现,如人类偏肺病毒(HMPV)、博卡病毒(Boca)和H1N1甲型流感病毒等,但最常见的呼吸道病毒仍主要为呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒(PIV1、PIV2和PIV3)、冠状病毒(OC43和229E)和鼻病毒(HRV)等。快速有效的呼吸道病毒检测方法是目前热门且尚有争议的。为此本研究采用直接免疫荧光法(DFA)和多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR)对540例呼吸道感染患儿鼻咽分泌物进行病毒检测,比较2种方法的检测结果。

材料和方法
一、材料

1.对象 2009年1月至2010年3月期间在上海市儿童医院因呼吸道感染收治入院患儿的鼻咽部分泌物540例。其中男322例、女218例,年龄10 d~14岁。

2.仪器与试剂 ABI7900扩增仪;Bio-Rad电泳仪;Bio-Rad凝胶成像仪;Olympus荧光显微镜;美国DHI公司直接免疫荧光试剂盒(D3 Diagnoatic Hybrida);罗氏MagnaPure自动抽提试剂盒(Roche);cDNA合成试剂盒(Fermantas);多重PCR检测试剂盒(Seegene)

二、方法

1. 标本收集和处理 由专职人员将一次性采样导管经鼻腔插入78 cm达到咽部以下,诱导吸取1.02.0 mL分泌物置于1015 mL无菌离心管中,避免混入唾液及奶液而影响检出率,标本2 h内送检。

2. DFA 标本加入磷酸盐缓冲液(PBS )4.08.0 mL,将鼻咽分泌物标本打匀,2 000 r/min(离心半径为10 cm)离心10 min后去除上清液留沉淀,用PBS洗涤数次,洗涤要彻底,减少黏液产生的非特异性荧光。最后将沉淀物溶解在0.5~1.0 mL的PBS中,吹打成细胞悬液,在玻片上点8个样孔(25 μL/孔)分别用于检测RSV、ADV、FluA、FluB、PIV1、PIV2、PIV3、HMPV。玻片于室温下干燥,冷丙酮固定10 min,每个样孔点加1滴相应的荧光抗体,37 ℃孵育30 min,用洗涤液洗涤后加一滴封闭液,封片后在荧光显微镜下观察结果。镜下,阳性细胞内显示亮绿荧光,阴性被Evans蓝染色红色,200倍显微镜下每视野找到≥2个绿色荧光细胞为阳性。

3. 多重RT-PCR试验 (1)核酸提取:罗氏MagnaPure自动抽提试剂盒(Roche),使用自动核酸提取仪进行核酸抽提,标本量选择200 μL,获得核酸量选择70 μL;(2)反转录获的第1链cDNA :cDNA合成试剂盒(Fermantas),在PCR反应管中加入3 μL焦碳酸二已酸(DEPC)处理的H2O,1 μL随机6聚体引物,8 μL上述抽提得到的核酸标本,在PCR仪中80 ℃保温3 min,冰上冷却2 min。然后向管内加入8 μL混合液(5×RT 缓冲液4 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、20 U/μL RNA酶抑制剂1 μL、200 U/μL逆转录酶1 μL)进行cDNA合成反应(37 ℃ 90 min,94 ℃ 2 min,冰上冷却2 min),获得的cDNA标本置-20 ℃保存待用;(3)多重RT-PCR扩增:采用多重呼吸道病毒PCR检测试剂盒将上述获得的cDNA第1条链标本同时进行2组多重PCR反应,其中第1组(RV1A)检测ADV(目的条带534 bp)、HMPV(目的条带749 bp)、冠状病毒229E(目的条带375 bp),PIV1、PIV2、PIV3(目的条带分别为139/264/188 bp),第2组(RV1B)检测FluA、FluB(目的条带分别为206/754 bp)和RSV A/B型(目的条带分别为273/143 bp)、冠状病毒OC43(目的条带578 bp)、HRV(目的条带394 bp),2组反应按如下加样,cDNA 3 μL、5×RV1A或5×RV1B引物4 μL、8-Mop溶液3 μL、2×Master Mix 10 μL,然后进行多重RT-PCR扩增(94 ℃预变性15 min、94 ℃变性30s、60 ℃退火1.5 min、72 ℃延伸1.5 min,40个循环之后72 ℃延伸10 min),多重PCR产物置4 ℃保存待电泳检测;(4)电泳检测扩增产物:取5 μL PCR产物、5 μL RV1A marker或RV1B marker进行电泳检测,电泳条件为2%琼脂糖凝胶,100 V电泳约1 h;凝胶成像系统观察结果,产物条带与阳性对照扩增条带进行对比,在同一位置出现扩增条带判断为该种病毒阳性。

三、统计学方法

采用SPSS软件进行统计分析,率的比较采用χ2检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、2种方法检测结果

540例患者标本中用DFA检测出RSV、FluA、FLuB、PIV1、PIV2、PIV3、HMPV、ADV共237例,检出率为43.9%(237/540)。多重RT-PCR检出301例,检出率为55.7%(301/540)。多重RT-PCR阳性检出率明显高于DFA(χ2 =29.093, P<0.01)。

多重RT-PCR除了检测上述8种病毒之外还可以检测冠状病毒OC43、229E和HRV,RSV可检测RSVA和RSVB 2个亚型。

2种方法的检测结果显示RSV是最常见的病毒,其次是PIV3和ADV。各种病毒的检出率见 表1。2种方法检测的阳性结果分别见 图1和 图2。

表1 237例呼吸道病毒感染的阳性病例不同方法诊断结果[例数(%)]

图1 DFA的阳性结果

图2 多重RT-PCR的阳性结果

二、2种方法的比较

540例标本中DFA和多重RT-PCR同时阳性163例,DFA阳性而多重RT-PCR阴性74例,多重RT-PCR阳性而DFA阴性138例,同时阴性165例。2种方法对病毒检测情况的比较见 表2。

表2 DFA和多重RT-PCR对8种呼吸道病毒诊断的相关情况

DFA和多重RT-PCR同时阳性的163例标本中,15例两者检测结果不一致,符合率是91%。15例结果不一致中,13例多重RT-PCR为HRV,DFA为RSV;1例多重RT-PCR为PIV2,DFA为PIV3;1例多重RT-PCR为FluB,DFA为PIV3。

138例多重RT-PCR阳性、DFA阴性的标本中,84例为RSV等8种常见病毒,12例为冠状病毒,42例为HRV。

讨论

本研究采用DFA和多重RT-PCR对540例来自上海市儿童医院的急性呼吸道感染标本进行诊断,结果显示RSV是患儿呼吸道感染最常见病毒,其次是PIV3和ADV,HMPV和FluA也是患儿呼吸道感染重要病毒。DFA检测阳性率是43.9%(237/540),多重RT-PCR检测阳性率是55.7%(301/540)。多重PCR阳性检出率显著高于DFA( P<0.01)。

本研究采用多重呼吸道病毒PCR可检测包括冠状病毒、HRV等12种呼吸道病毒, 在301例多重RT-PCR阳性标本中检出冠状病毒229E 3例、OC43 9例,HRV 42例,其病原谱种类优于DFA。

DFA和多重RT-PCR同时阳性的163例标本中,15例检测结果不一致,两者符合率为91%。15例结果不一致其原因可能是病毒抗原之间交叉所致。此外,DFA在结果判断上存在一定主观性, 易出现假阳性或假阴性结果,检测者对结果判断起非常重要作用,此外也应特别注意操作方法,孔与孔之间要有比较明显的分界,以免试剂之间的污染,造成结果偏差。

本研究中有138例标本多重RT-PCR阳性而DFA阴性,说明多重RT-PCR的检测敏感性高于DFA。 DFA阳性而多重RT-PCR阴性74例,分析原因可能是该批标本在运输途中保存不当,造成反复冻融,致使核酸含量减弱。提示今后的实验中应避免发生类似情况,及时检测,以提高检测阳性率和准确性。

DFA和多重RT-PCR是目前快速检测呼吸道常见病毒的2种主要方法。DFA是对病毒抗原直接进行检测,可在荧光显微镜下直接观察上皮细胞内病毒感染情况,被认为是临床诊断病原体的金标准[ 2]。DFA能同时检测8种病毒,实验需时较短,标本送到实验室2 h就可得出结果,设备仅需荧光显微镜,在普通实验室即可开展,是一种快速、简便、特异性及敏感性高的诊断呼吸道病毒感染的方法[ 3]。适用于临床检测,能为临床诊断和有效治疗提供快速的依据。

多重RT-PCR是一种新型技术,可使某些不能培养或难以培养的病毒得以检测,符合目前对检测技术高通量快速的要求,是今后的发展趋势。多重RT-PCR是体外特异DNA扩增法,该方法的最大特点是敏感、特异,可使某些不能培养或难以培养的病毒得以检测,并可根据DNA条带位置准确鉴定病毒的种类、型和亚型[ 4]。本研究中多重RT-PCR即可对RSV进行分型,这有利于流行病学的调查,为疫苗的研制及预防提供依据。

DFA和多重RT-PCR值得在临床推广使用。临床实验室可以根据自身实际情况及临床需要对2种方法进行选择使用或配合使用,对早期诊断治疗、疾病预防控制和预警具有重要的意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 陆学东, 陆长东, 周一平, 等. 呼吸道病毒感染多重、快速检测技术[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2006, 26(8): 760. [本文引用:1]
[2] Templeton KE, Scheltimga SA, Beersma MF, et al. Rapid and sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis of infections by influenza A and influenza B viruses, respiratory syncytial virus, and parainfluenza viruses 1, 2, 3 and 4[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(4): 1564-1569. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[3] 黄蓉, 段荣. 呼吸道病毒检测方法进展与临床意义[J]. 实验与检验医学, 2009, 27(4): 393-396. [本文引用:1]
[4] 孙丽霞, 黄敬孚. 呼吸道病毒检测与临床意义[J]. 中国医学工程, 2005, 13(3): 325-326. [本文引用:1]