引用本文
萧晨路, 韩立中, 孙景勇, 倪语星. 鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌体外抗菌活性的分析及培养基的影响. 2011, 26(9): 582-585
XIAO Chenlu, HAN Lizhong, SUN Jingyong, NI Yuxing. Analysis on vitro antibacterial activity and medium influence ofAcinetobacter baumannii andPseudomonas aeruginosa . Labratory Medicine, 2011, 26(9): 582-585  
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鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌体外抗菌活性的分析及培养基的影响
萧晨路, 韩立中, 孙景勇, 倪语星
上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科,上海 200025

通讯作者：倪语星,联系电话：021-64370045-600630。

作者简介：萧晨路,女,1984年生,学士,技师,主要从事临床微生物研究。

基金:上海市科委课题项目(090Z1907700);
摘要
目的

了解当前鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌的体外抗菌活性以及在低碱性氨基酸培养基中对碳青霉烯类抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)的影响。

方法

收集临床分离的鲍曼不动杆菌47株、铜绿假单胞菌53株。按美国临床实验室标准化协会(CLSI)琼脂稀释法检测菌株对帕尼培南、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、 头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星10种抗菌药物的MIC;同法分别检测鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌在低碱性氨基酸培养基和水解酪蛋白胨(MH)培养基上对帕尼培南、亚胺培南、美罗培南的敏感性。采用配对t检验比较2组试验结果。

结果

47株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、左氧氟沙星的耐药率最低,分别是17.10%和14.90%,哌拉西林-他唑巴坦耐药率高达78.70%。53株铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率最低,为20.75%;头孢他啶的耐药率高达71.70%。在低碱性氨基酸的培养基中,鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌对碳青霉稀类抗菌药物的敏感性差异有统计学意义(P<0.05)。

结论

碳青酶烯类药物是治疗鲍曼不动杆菌引起的重症感染的重要药物。由于碱性氨基酸的浓度较高,鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性在使用MH培养基检测时被低估。

关键词: 鲍曼不动杆菌; 铜绿假单胞菌; 最小抑菌浓度; 抗菌活性; 低碱性氨基酸培养基
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)09-0582-04
Analysis on vitro antibacterial activity and medium influence ofAcinetobacter baumannii andPseudomonas aeruginosa
XIAO Chenlu, HAN Lizhong, SUN Jingyong, NI Yuxing
Department of Microbiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To investigate the antibacterial activity ofAcinetobacter baumannii andPseudomonas aeruginosa in vitro, and analyze the minimal inhibitory concentration (MIC) of carbapenems antibiotics in low amino acid medium.

Methods

A total of 47Acinetobacter baumannii strains and 53Pseudomonas aeruginosa strains were collected. According to Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) standard agar dilution method, the MIC of 10 antibiotics as panipenem, imipenem, meropenem, ceftazidime, cefoperazone-sulbactan, tazobactam-piperacillin, cefepim, levofloxacian, ciprofloxacin and amikacin were determined, and the sensitivities ofAcinetobacter baumannii andPseudomonas aeruginosa to panipenem, imipenem and meropenem in low amino acid medium and Mueller-Hinton (MH) medium were determined. The results of 2 groups were compared by pairedt test.

Results

The resistance rates of imipenem and levofloxacin to 47Acinetobacter baumannii strains were the lowest (17.10% and 14.90%). The resistance rate of tazobactam-piperacillin was high as 78.70%. The resistance rate of amikacin to 53Pseudomonas aeruginosa strains was the lowest (20.75%), and the resistance rate of ceftazidime was high as 71.70%. The sensitivities ofAcinetobacter baumannii andPseudomonas aeruginosa had statistical significance (P<0.05) in low amino acid medium.

Conclusions

Carbapenems antibiotics have great effect onAcinetobacter baumannii infection diseases. For high concentration of low amino acid, the sensitivity of carbapenems toAcinetobacter baumannii andPseudomonas aeruginosa is underestimated in MH medium.

Keyword: Acinetobacter baumannii; Pseudomonas aeruginosa; Minimal inhibitory concentration; Antibacterial activity; Low amino acid medium

不发酵糖革兰阴性杆菌(如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌)是医院感染常见病原菌。近年来各种插管、导管、机械通气等应用不断增加,此类菌的检出也不断增多。碳青霉烯类抗菌药物对包括超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶在内的大多数β-内酰胺酶稳定,与青霉素结合蛋白亲和力强,能有效透过细菌外膜进入周质间隙,具有抗菌谱广、杀菌活性强的特点,被认为是目前临床治疗非发酵革兰阴性菌感染的最有效的抗菌药物之一。目前常用于治疗医院感染的主要是亚胺培南、帕尼培南和美罗培南。不过近年来世界各地对碳青霉烯类抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的分离率也逐渐增高。因此,监测这2种细菌的耐药性的变化趋势对于制订临床有效的抗感染治疗具有非常重要的意义。尤其是最低抑菌浓度(MIC)的测定对于利用药代动力学/药效学(PK/PD)的原则建立临床用药方案有很大的帮助。另外,目前也有报道水解酪蛋白胨(MH)培养基中碱性氨基酸的含量对铜绿假单胞菌的碳青霉烯类抗菌药的敏感试验有很大影响,但对鲍曼不动杆菌药物敏感试验有无影响未知。因此,本研究对低碱性氨基酸培养基对鲍曼不动杆菌药物及铜绿假单胞菌药物敏感试验的影响进行初步的探讨。

材料和方法
一、菌株来源

收集2009年5月至10月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床分离的鲍曼不动杆菌47株、铜绿假单胞菌53株,共计100株。应用VITEK微生物全自动分析仪、API鉴定系统ABioFoSun系统鉴定到种,详细记录菌株的患者和标本信息。以铜绿假单胞菌 (ATCC 27853)为质控菌株。

二、药敏试验

按美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准琼脂稀释法倍比稀释检测47株鲍曼不动杆菌及53株铜绿假单胞菌对帕尼培南、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星10种抗菌药物的MIC,倍比稀释14个浓度(使培养基抗菌药物最终浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.15 mg/L)。同法检测2种细菌在低碱性氨基酸培养基和MH培养基上对帕尼培南、亚胺培南、美罗培南的敏感性。观察结果分别统计出MIC50、MIC90范围,并根据CLSI折点计算对不同细菌的敏感百分率。

三、低碱性氨基酸培养基成分

葡萄糖 1.0 g, 磷酸二钾 7.0 g, 磷酸二氢钾 2.0 g,柠檬酸钠 0.5,硫酸镁 0.1,硫酸铵 15.0 g。

四、统计学方法

采用SPSS软件配对 t检验比较低碱性氨基酸培养基和MH培养基2组试验结果, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、鲍曼不动杆菌的耐药性

47株鲍曼不动杆菌在10种抗菌药物中,帕尼培南因为缺乏判断的折点,无法计算耐药率。MIC50、MIC90从低到高依次为环丙沙星(≤0.064/16)、左氧氟沙星(1/4)、亚胺培南(4/16)、美罗培南 (4/32)、帕尼培南(8/32)等。阿米卡星的MIC50较低,为0.5;但MIC90高达256;头孢他啶的MIC50、MIC90均为256。

亚胺培南、左氧氟沙星的耐药率最低,分别是17.10%和14.90%,环丙沙星、阿米卡星、头孢吡肟和头孢哌酮-舒巴坦的耐药率依次为38.20%、44.70%、48.90%和51.00%,其余抗菌药物的耐药率均在较高的水平。哌拉西林-他唑巴坦对鲍曼不动杆菌体外活性最差,耐药率高达78.70%,见 表1。

表1 47株鲍曼不动杆菌对10种抗菌药物的MIC50、MIC90及耐药率
二、铜绿假单胞菌的耐药性

53株铜绿假单胞菌在10种抗菌药物中,帕尼培南因为缺乏判断的折点,无法计算耐药率。MIC50、MIC90从低到高依次为亚胺培南(2/16)、帕尼培南(4/16)、美罗培南(8/32),头孢他啶的MIC50、MIC90最高(64/256)。

哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、亚胺培南耐药率分别为22.60%、20.75%、37.70%;其余抗菌药物的耐药率均在较高的水平。头孢他啶的耐药率高达71.70%,见 表2。

表2 53株铜绿假单胞菌对10种抗菌药物的MIC50、MIC90及耐药率
三、低碱性氨基酸培养基的影响

1. 用低碱性氨基酸培养基检测鲍曼不动杆菌耐药性 在低碱性氨基酸培养基中帕尼培南缺乏判断的折点,无法计算耐药率。MIC50、MIC90从低到高依次为帕尼培南(0.03/0.50)、亚胺培南(0.03/0.06)、美罗培南(1.00/4.00)。本次检测未发现鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药的菌株,见 表3。鲍曼不动杆菌在低碱性氨基酸培养基和MH培养基上对碳青霉烯类抗菌药物的MIC值差异具有统计学意义(亚胺培南 t=5.887, P<0.05;美罗培南 t=9.224, P<0.05)。

表3 2种药敏培养基对鲍曼不动杆菌碳青霉烯类药物MIC50、MIC90影响的比较

2. 用低碱性氨基酸培养基检测铜绿假单胞菌耐药性 在低碱性氨基酸培养基中帕尼培南缺乏判断的折点,无法计算耐药率。MIC50、MIC90帕尼培南和美罗培南相同(0.50/2.00)、亚胺培南最高(为2.00/4.00)。本次检测未发现铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的菌株,对美罗培南耐药的菌株有1株(0.01%),见 表4。铜绿假单胞菌在低碱性氨基酸培养基和MH培养基上对碳青霉烯类抗菌药物MIC值的差异具有统计学意义(亚胺培南 t=5.123, P<0.05;美罗培南 t=6.760, P<0.05)。

表4 2种药敏培养基对铜绿假单胞菌碳青霉烯类药物MIC50、MIC90影响的比较
讨论

鲍曼不动杆菌是一种重要的不发酵糖革兰阴性杆菌。在免疫力低下,接受侵袭性操作的患者中,能引起呼吸机相关性肺炎、脓毒症、泌尿系统感染、脑膜炎等严重的、甚至致死性的感染。该菌对多数常用抗菌药物耐药率高,尤其对泛耐药菌株的临床治疗困难。碳青酶烯类药物是治疗鲍曼不动杆菌重症感染的重要药物,本研究鲍曼不动杆菌的体外抗菌作用也说明了这一点[ 1, 2]。

CLSI M100-S17文件建议,对铜绿假单胞菌严重感染患者的治疗采用大剂量抗假单胞菌青霉素或加酶抑制剂复合制剂[ 3],并推荐与氨基糖苷类或氟喹诺酮类联合应用[ 4]。本研究中53株铜绿假单胞菌对各种抗假单胞菌抗菌药物的体外活性比较结果显示,对阿米卡星的耐药率仅为20.75%,提示铜绿假单胞菌感染患者的治疗中,抗假单胞菌作用的β-内酰胺类加氨基糖苷类仍是一个很好的联合用药组合。

MIC分析发现,在低碱性氨基酸培养基上,碳青霉烯类抗菌药物对鲍曼不动杆菌的MIC50和MIC90值降低约3到5个梯度。在低碱性氨基酸培养基中鲍曼不动杆菌没有发现对亚胺培南和美罗培南耐药的菌株。经统计学分析,鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌在MH培养基上及低碱性氨基酸培养基中对碳青霉烯类抗菌药物MIC值的差异具有统计学意义。

在对这100株菌的患者进行回顾性调查后,有5例出院,33例临床用药情况无法得知,其余67例(包括出院5例)在送检各类标本培养出铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌后,均使用了碳青霉烯类抗菌药物并获得满意的疗效。

在铜绿假单胞菌的体外药敏监测中,培养基中碱性氨基酸含量的多少对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性有显著影响。根据文献[ 5]报道,碳青霉烯类抗菌药物是具有双极性、亲水性的小分子,经D2蛋白孔道穿过铜绿假单胞菌的外膜,而D2孔道同时又是碱性氨基酸或包含有碱性氨基酸的小肽的运输通道[ 5]。有研究发现,碱性氨基酸可竞争性抑制亚胺培南通过D2外膜蛋白孔道。所以在低碱性氨基酸培养基中,由于氨基酸对碳青霉烯类抗菌药物通过D2外膜孔道的竞争减少,从而提高了碳青霉烯类抗菌药物的通透,使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物敏感性提高[ 6]。由于MH培养基中碱性氨基酸的含量是人体血清氨基酸量的40倍左右,所以在常规药敏试验(用MH培养基)时,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性被低估,如果用接近人体血清氨基酸含量的低氨基酸培养基做铜绿假单胞菌的药敏试验,能更好地反映碳青霉烯类抗菌药物在体内的抗菌活性。本研究发现鲍曼不动杆菌也与铜绿假单胞菌一样,培养基中碱性氨基酸含量的多少对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性有显著影响,其机制有待进一步探讨。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Clinical Laboratory Stand ards Institute. Performance stand ards for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S16, CLSI, 2006. [本文引用:1]
[2] Simor AE, Lee M, Vearnocombe M, et al. An outbreak due to multiresistant Acinetobacter baumannii in a burn unit: risk factors for acquisition and management[J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 2002, 23(5): 261-267. [本文引用:1]
[3] Clinical Laboratory Stand ards Institute. Performance stand ards for antimicrobial susceptibility resting[S]. M100-S17, CLSI, 2007. [本文引用:1]
[4] Livermore DM, Winstanley TG, Shannon KP. Inter-pretative reading: recognizing the unusual and inferring resistance mechanisms from resistance phenotypes[J]. J Antimicrob Chemother, 2001, 48(Supp 1): 87-102. [本文引用:1] [JCR: 5.338]
[5] 颜英俊, 刘华, 杨明清, 等. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药相关基因的研究[J]. 中国抗生素杂志, 2008, 33(11): 663-667. [本文引用:2]
[6] Ochs MM, McCusker MP, Bains M, et al. Negative regulation of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin OprD selective for imipenem and basic amino acids[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43(5): 1085-1090. [本文引用:1]