甲型H1N1流感病毒属于正黏病毒科(0rthomyxoviridae),甲型流感病毒属( Influenza virus A)。为单股负链RNA病毒,基因组约为13.6 kb,由8个片段组成,共编码10个蛋白,其中节段1编码聚合酶碱性蛋白1(polymemse basic protein1,PB1),节段2编码聚合酶碱性蛋白2(polymemse basic protein 2,PB2),节段3编码聚合酶酸性蛋白(polymerase acidic protein,PA),节段4编码血凝素(hemagglutinin,HA),节段5编码核蛋白(nuclear protein,NP),节段6编码神经氨酸酶(neuraminidase,NA),节段7编码基质蛋白1和2(matrix protein 1/2,M1/2),节段8编码非结构蛋白1和2(nonstructural protein 1/2,NSl/2)。根据病毒表面蛋白HA和NA的不同将甲型流感分为了不同的亚型。此次出现的新型甲型H1N1流感病毒,其PB2、PB1、PA、HA、NP和NS基因片段来自禽、猪和人流感病毒三重重组的猪流感病毒, NA、M基因片段来自欧亚地区的猪流感病毒。其抗原性与经典猪甲型HlN1流感病毒、北美系来源的三重重组的猪甲型H1N1流感病毒极其相似^{[ 1]}。

1.M2离子通道阻滞剂 M2离子通道阻滞剂为金刚烷类药物如金刚烷胺、金刚乙胺。此类药物可与流感病毒的M2蛋白离子通道结合并阻断其功能区,从而抑制病毒的复制,阻止病毒感染新的细胞。其耐药分子机制是由于M2蛋白跨膜区的部分氨基酸突变,主要发生在26、27、30、31和34位氨基酸^{[ 2, 3]},其中以31位丝氨酸-天冬氨酸(S31N)替换多见,其次为27位缬氨酸-异亮氨酸(V27I)替换^{[ 3]}。由于氨基酸替换,金刚烷胺不能与离子通道结合,无法抑制病毒复制而发生感染。

金刚烷胺和金刚乙胺分别于1966年和1993年被美国批准用于流感的预防与治疗。在流感症状出现的48 h内应用此类药物可使流感症状持续时间缩短1.5 d,其预防效率为80%~90%^{[ 3]}。但近年来对耐金刚烷类药物流感病毒的监测显示其耐药数量显著增加,美国1995至2002年金刚烷胺类药物耐药率仅为2%,到2004年则增至12.3%。Bright等^{[ 3]}对美国26个州从2005年10月1日至12月31日分离得到的流感标本进行检测显示,209份H3N2流感标本中有109份(92.3%)、8份H1N1流感标本中有2份(25%)为金刚烷类耐药,均表现为31位丝氨酸被天冬氨酸替换,其中6份H3N2流感标本还表现为27位缬氨酸被异亮氨酸替换。我国2003至2005年流感季节分离到的41株H3N2流感标本有30份(70%)为金刚烷胺耐药,表现为31位丝氨酸被天冬氨酸替换^{[ 4]}。日本2007至2008年流感季节检测的663份H1N1流感标本中有411份(62%)、56份H3N2标本(100%)均为金刚烷胺耐药^{[ 2]}。临床发现,应用金刚烷胺时,约30%患者出现耐药病毒,小儿约80%可检出耐药病毒。耐金刚烷胺病毒早在治疗的第2日即可检出,并保持了与亲代株相匹敌的感染性及传播力^{[ 5]}。有研究表明,此次流行的甲型H1N1流感病毒出现特有的M2蛋白I43T(异亮氨酸-苏氨酸)氨基酸替换,可用于区别其他种系及亚型病毒;并且存在S31N氨基酸替换的遗传标记而对金刚烷胺耐药^{[ 6]}。

2.NA抑制剂(NAIs) 目前NAIs主要有扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir)、帕拉米韦(peramivir),前两者已被批准用于流感的预防与治疗,后者正在进行三期临床试验。病毒在宿主细胞内复制后以出芽方式从宿主细胞表面释放,病毒表面的血凝素HA与宿主细胞表面唾液酸相连,而病毒表面的NA能水解唾液酸,从而使病毒释放出来以继续感染其他正常细胞。NAIs能模仿NA的天然底物唾液酸与NA结合,阻断其活性位点,使之不能催化水解唾液酸,阻止病毒颗粒的释放。其耐药分子机制主要有2个方面,一方面是由于病毒NA活性中心氨基酸被替换,使酶功能受损而出现耐药性。主要发生在274/275位组氨酸-酪氨酸(H274/275Y),292位精氨酸-赖氨酸(R292K),294/295位天冬酰胺-丝氨酸(N294/295S)替换。另一方面是由于病毒表面HA受体的结合位点或附近发生改变,主要发生在V116、I117、E119、Q136、D199、I223等位置^{[ 6]},使HA与宿主细胞表面受体结合的亲和力降低,病毒对NA功能的依赖性减少^{[ 7]},因此降低了病毒对NAIs的敏感性。而病毒对NAIs敏感性的降低主要依赖于病毒HA与其受体结合效率的降低和受体结构的改变。影响病毒结合效率的因素包括病毒表面组成HA受体结合片段的氨基酸残基及数量、位置及HA分子上的寡糖基团的结构^{[ 8]}。

2002年的一项研究表明,在小鼠及雪貂模型中,NA H274Y突变显著降低了H1N1流感病毒的复制及毒力,同时也表现在药物压力下的连续传代细胞及治疗的患者中^{[ 9]}。对奥司他韦的临床试验表明,耐药性较为少见(成年人为0.32%,儿童为4.1%),少数治疗期间分离到的奥司他韦耐药毒株并无重要临床意义。2006至2007年的流感季节里,奥司他韦耐药毒株的传播是很少见的^{[ 9]}。然而,2008年夏季,在南半球及南非流行的H1N1已完全对奥司他韦耐药。2008年12月19日,美国疾病控制中心报道,几乎所有的甲型H1N1流感病毒对奥司他韦耐药。Dharan等^{[ 9]}分析了268份H1N1流感标本,其中有264份(98.5%)为奥司他韦耐药,然而这些带有H274Y突变的奥司他韦耐药毒株对扎那米韦敏感。其机制为NA与奥司他韦的结合需要其276位密码子的谷氨酸残基侧链发生构象改变,但与扎那米韦结合则不需要这种构象改变。Hurt等^{[ 10]}研究显示2006~2008年澳大利亚和东南亚地区分离到的H1N1流感标本有2.3%对扎那米韦敏感性显著降低,表现为136位谷氨酰胺被赖氨酸替换(Q136K)的突变。这种突变可使病毒对扎那米韦的敏感性降低300倍,对帕拉米韦的敏感性降低70倍,但对奥司他韦的敏感性却没有影响。此种突变在临床标本和培养的MDCK细胞中的发生率很低。相对于敏感的流感毒株,Q136K突变株在培养的MDCK细胞中显示出比野生型毒株较高的适应性及在雪貂动物模型中表现出相似的感染性和传播力。有研究人员对99例奥司他韦耐药病例与182例奥司他韦敏感病例进行比较,两者在诱发因素、临床症状及流感相关并发症方面并无明显差异。在2007~2008年流感季节,美国有约10.9%H1N1流感病毒为奥司他韦耐药,加拿大为26%,欧洲为25%,香港为12%,而挪威为67.3%,但奥司他韦在挪威为处方药并很少使用。而在普遍使用奥司他韦的日本,其耐药毒株仅为3%^{[ 9]}。由此可见这种耐药毒株似乎是一种自然的、自发的变异,而与药物使用压力下的选择作用无关^{[ 11]}。一项对H1N1毒力的动物实验研究证实,H274Y突变并不一定降低其亲和力、酶活性、病毒复制及致病力。流感病毒的适应性受其血凝素和NA蛋白功能性平衡的影响。H274Y突变减弱了NA底物的亲和力,使血凝素与NA的相对活性恢复到平衡而增强了毒株的整体适应性^{[ 9]}。此次流行的甲型H1N1流感病毒仍然对NAIs类药物敏感,只有少数患有免疫缺陷的流感患者身上发现有耐药毒株的出现^{[ 12]},其原因还有待进一步研究。

流感病毒耐药性的检测可分为基因型分析和病毒表型分析。基因型分析是检测在抗病毒药物的诱导下流感病毒是否出现基因位点的突变。表型分析是检测在体外某种抗病毒药物压力下50%培养物感染剂量的病毒滴度,以确定病毒对抗病毒药物的敏感性。过去建立的检测抗病毒药物敏感性的方法有:在某种抗病毒药物压力下50%培养物感染剂量的病毒滴度测定和限制性片段长度多态性聚合酶链反应(RFLP-PCR)分析。其他的还有空斑减少试验、免疫荧光分析、耐药毒株的DNA测序^{[ 2]}。序列分析是目前用于监测NAIs抑制剂耐药性并确定其敏感性降低的分子标记的主要方法。最近,焦磷酸测序和实时荧光定量PCR成为一种快速的检测方法。但这些方法需要专业的实验人员和昂贵的仪器,不是每个实验室都具备这样的条件。而且由于病毒基因的漂移、引物或探针结合区的突变会使分析方法的敏感性降低。因此设计简并引物和探针是避免其敏感性降低的较好方法。同时,这种新的分子检测方法也可以用于前瞻性的临床研究,以确定感染野生型和突变型流感病毒的患者长期治疗的效果是否存在差异^{[ 13]}。2009年5月15日,军事医学科学院研制成功了我国首个针对甲型H1N1流感病毒抗药性的基因确诊和耐药性分析的基因芯片,这种芯片采用具有自主知识产权的纳米标记信号放大技术,能准确检测甲型H1N1流感病毒、对普通季节性毒株和新流行的毒株进行鉴别,并能准确检测病毒的耐药性突变位点,从而判断出病毒是否对已广泛应用的达菲类药物产生耐药性。

世界卫生组织在1999年建立了耐药性监测机构——NAIs抑制剂敏感性全球网络(neuraminidase inhibitor susceptibility network,NISN),其目的是收集数据并监视耐药性的出现,确定是否存在耐药突变下的敏感性降低,并用于讨论公共健康及可能出现的耐药性监管问题。这突出了临床标本NAIs敏感性检测的重要性。近年来人们利用计算机技术建立了相关的数学模型用于研究空间人群对疫情及干预有效性的影响,特别是计算机模拟可以有效地指导抗病毒药物的使用^{[ 14]}。随着流感病毒耐药率的逐年上升,耐药毒株的传播也对我们提出了警示:对病毒耐药性的监测显得尤为重要,其对于流感疫情控制,指导临床用药具有重要意义。