引用本文
马江涛, 庞新利, 吴文苑. 脂蛋白残粒检测方法的评价及在冠心病中的初步应用. 26(8): 544-547
MA Jiangtao, PANG Xinli, WU Wenyuan. The evaluation on method of remnant lipoprotein detection and its primary application in coronary heart diseas. Labratory Medicine, 26(8): 544-547  
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脂蛋白残粒检测方法的评价及在冠心病中的初步应用
马江涛, 庞新利, 吴文苑
深圳市人民医院,广东 深圳 518000

作者简介：马江涛,男,1970年生,学士,副主任技师,主要从事临床生物化学检验和质量管理工作。

基金:广东省深圳市科技计划项目（201002011）;
摘要
目的

对免疫分离法测定血清脂蛋白残粒(RLP)进行方法学评价,分析该方法在冠心病患者血清RLP临床检测中的应用。

方法

评价免疫分离法测定血浆RLP的精密度、稳定性试验、回收试验、干扰试验、线性范围。用该法测定100名体检健康者、59名冠心病患者空腹血清RLP水平,同时测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(apo A1)和载脂蛋白B(apo B),比较7个项目的临床符合率。

结果

免疫分离法测定高(0.48 mmol/L)、低浓度(0.12 mmol/L)血清RLP的批内变异系数(CV)分别为4.6%、4.2%,平均为4.4%;批间CV分别为5.8%、6.0%,平均为5.9%。平均回收率为98.7%。血清样本4 ℃可保存4 d以上,-20 ℃可稳定保存1个月以上。血红蛋白(Hb)<5 g/L、胆红素<300 μmol/L、TG<14.1 mmol/L时对RLP测定无明显干扰;RLP在2.0 mmol/L范围内线性良好。体检健康人群RLP参考范围为(0.18±0.04) mmol/L。冠心病患者空腹血清RLP浓度为(0.31±0.072)mmol/L,明显高于正常对照组(P<0.01);其临床符合率为79.7%,高于TG(44.0%)、TC(30.5%)、LDL-C(28.8%)、apo B(27.1%)、apo A1(25.4%)和HDL-C(18.6%)。

结论

免疫分离法测定RLP操作简单,结果准确、可靠,符合临床质控要求,适用于基础研究和临床检验。RLP可作为冠心病的致病因子应用于临床。

关键词: 脂蛋白残粒; 冠心病; 动脉粥样硬化; 免疫分离法
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)08-0544-04
The evaluation on method of remnant lipoprotein detection and its primary application in coronary heart diseas
MA Jiangtao, PANG Xinli, WU Wenyuan
Shenzhen People's Hospital, Guangdong Shenzhen 518000,China
Fund:
Abstract
Objective

To evaluate immunoseparation assay for remnant lipoprotein (RLP) detection and its clinical application significance in patients with coronary heart disease.

Methods

The precision, stability, recycling, interference and linearity were analyzed for RLP by immunoseparation assay. The fasting serum RLP,triglyceride(TG), total cholesterol(TC), high density lipoprotein cholesterol(HDL-C),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C),apolipoprotein A1(apo A1) and apolipoprotein B (apo B)were assayed for 100 healthy subjects and 59 patients with coronary heart disease. The coincidence was analyzed.

Results

The within-run coefficients of variation (CV) of the assay from high levels(0.48 mmol/L) and low level (0.12 mmol/L) of RLP were 4.6% and 4.2% respectively, and the between-runCV were 5.8% and 6.0%. The average within-run and between-runCV were 4.4% and 5.9%. The mean recovery rate was 98.7%. The serum samples could be preserved for >4 d at 40 ℃ and >1 month at -20℃. Hemoglobin(Hb<5 g/L),bilirubin(<300 μmol/L) and TG (<14.1 mmol/L) did not interfere in the immunoseparation assay for RLP. There was an excellent linearitty with RLP within 2.0 mmol/L. The levels of RLP in patients with coronary heart disease[(0.31±0.072) mmol/L] were significantly higher than those in normal controls [(0.18±0.04)mmol/L](P<0.01). The clinical conformity rate of RLP(79.9%) was higher than that of TG(44.0%), TC(30.5%), LDL-C(28.8%), apo B(27.1%), apo A1(25.4%)and HDL-C(18.6%).

Conclusions

The immnoseparation assay for RLP is a simple method with reliable accuracy and meets the clinical quality control demand,so it is suitable for clinical and basic research.RLP could be considered as a risk factor of coronary heart disease.

Keyword: Remnant lipoprotein; Coronary heart disease; Atherosclerosis; Immunoseparation assay

脂蛋白残粒( remnant lipoprotein,RLP)又称富含三酰甘油(TG)脂蛋白残粒(TRL),是乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)经脂蛋白脂酶(LPL)水解逐渐失去三酰甘油、磷脂、载脂蛋白A和载脂蛋白C,转变为富含胆固醇、胆固醇脂和载脂蛋白E的较小颗粒[ 1] 。越来越多的证据显示RLP与冠心病(CHD)的发病机制相关。有研究人员证实RLP能作为一个致动脉粥样硬化的因素[ 2]。我们对检测RLP的免疫分离法进行了方法学评价,同时分析了冠心病(CHD)患者RLP和其他血脂项目的变化[重点比较最主要的CHD致病因子——总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)],初步研究RLP在CHD中的临床价值。

材料和方法
一、样本来源

正常对照组均为深圳市人民医院健康体检者,共100名,其中男55名、女45名,年龄22~36岁。血常规、尿常规、空腹血糖、血脂、肝、肾功能、胸片、心电图等各项检查均正常,无慢性疾病。CHD组为深圳市人民医院心内科的CHD患者,共59例,其中男39例、女20例,年龄43~86岁,经临床及冠状动脉造影确诊。

二、样本采集

研究对象均于空腹12 h后抽取前臂肘静脉血4 mL,3000 r/min(离心半径15 cm)离心10 min后分离血清置于-20 ℃保存待检。

三、试剂和仪器

1. RLP试剂 采用免疫分离法。试剂盒由上海北加生化试剂有限公司提供,包括载脂蛋白B-100 (apo B100)和载脂蛋白A1(apo A1)单克隆抗体和促进剂的前处理液;试剂1 (R1)含有LPL、过氧化物酶、对-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林和缓冲液;试剂2 (R2)含胆固醇氧化酶、缓冲液和非反应性填充物及稳定剂。

2. RLP测定方法 (1) 原理:含有apo B100和apo A1单克隆抗体和促进剂的混合液与待测血清中含有apo B100和apo A1抗原的脂蛋白结合形成免疫复合物,剩余的与抗体未结合的部分主要是CM残粒和VLDL残粒,总称RLP;用胆固醇酶法测定RLP中胆固醇的含量来衡量RLP的多少;(2)方法:将复融的血清8 μL加110 μL前处理液混合,混匀后在室温放置30 min,用4 000 r/min(离心半径15 cm)离心10 min,取上清液测定其TC浓度。其他参数设置以试剂说明书为准。

3. 其他项目试剂 三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)用过氧化物酶终点法测定,两者均为Beckman公司原装试剂;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用直接酶法测定,试剂由日本积水医药株式会社提供; 载脂蛋白(apo A1)和载脂蛋白(apo B) 用免疫透射比浊法测定,试剂由利得曼有限公司提供。

4. 仪器 BECKMAN DXC800全自动生化分析仪。

四、方法

1.精密度 根据NCCLS EP5-A2文件对于精密度评价的要求,分别对低浓度(0.12 mmol/L)、高浓度(0.48 mmol/L)2个水平的混合血清进行精密度实验,2 h内各水平连续测定20次,计算均值( x- )、变异系数( CV);每天测定1次,连续测定20 d,计算 x- 、 CV。

2.稳定性试验 取混合血清3.0 mL ,分装10份,每份300 μL。其中4份2~8 ℃保存,每天取出1份测定,连续4 d,其余6份-20 ℃保存,每周取出1份,室温融解,放置30 min后测定,连续6周。

3.回收试验 取低浓度(0.12 mmol/L)和高浓度(0.48 mmol/L)的混合样本各1份,以不同比例混合成为4种浓度的分析样本,分别测定其RLP浓度,以测定值和理论值计算回收率。

4.干扰试验 用稀释好的不同浓度的血红蛋白(Hb)、胆红素(Bil)和TG乳糜分别与含RLP较高浓度(4.80 mmol/L)的血清进行1∶9 混合(首个浓度使用生理盐水)做回收试验,以回收率的高低判断干扰的程度。

5.线性范围 按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP6-P文件作线性评价标准,取1份高浓度RLP(2.00 mmol/L)样本和1份低浓度RLP(0.05 mmol/L)样本,然后等量混匀作中间值,再分别将中间值和高值、中间值和低值等量混匀,共产生5个不同浓度的样本,即0.05、0.54、1.03、1.52、2.00 mmol/L。在BECKMAN DXC800全自动生化分析仪上从低值到高值,然后从高值到低值对5个不同浓度的样本分别平行测定5次,求得 x- 为 Y,以理论值为 X,做线性回归分析。

五、临床应用

1.正常对照组 对100名体检者的血清RLP结果进行统计分析,计算参考范围。

2.CHD组 对TC、LDL-C、HDL-C、TG、apo A1、apo B及RLP 7个项目进行分析。TC、LDL-C正常、临界和升高标准根据《2006 中国成人血脂异常防治指南》中的TC、LDL-C 分层切点建议进行划分。以TC<5.18 mmol/L为正常,5.19~6.21 mmol/L为临界, >6.21 mmol/L为升高;LDL-C<3.37 mmol/L为正常,3.37~4.14 mmol/L为临界,>4.14 mmol/L为升高。本研究以TC>5.18 mmol/L、LDL-C>3.37 mmol/L为标准,其他指标以《全国临床检验操作规程》(第3版)为准。

四、统计学方法

所有数据采用计算机SPSS 13.0软件包进行统计学分析,结果以 x- ±s表示,组间差异采用 t检验和相关性分析。

结 果
一、方法学评价

1.精密度 免疫分离法测定高、低浓度血清RLP的批内 CV分别为4.6%、4.2%,平均为4.4%;批间 CV分别为5.8%、6.0%,平均为5.9%。均低于厂家提供的近似浓度的 CV,符合临床要求。

2.稳定性试验 2~8 ℃保存4 d的血清RLP结果分别为1.73、1.72、1.72、1.71 mmol/L;-20 ℃保存6周的血清RLP结果分别为1.71、1.70、1.68、1.66、1.66、1.63 mmol/L,浓度变化均未超过5%。混合血清样本4 ℃可保存4 d以上,-20 ℃可稳定保存1个月以上。

3.回收试验 平均回收率为98.7%,见 表1。

表1 回收试验结果

4.干扰试验 Hb<5 g/L、Bil<300 μmol/L、TG<14.1 mmol/L 时对测定RLP无明显干扰。见 表2。

表2 干扰试验结果

5.线性范围 经线性回归分析,得出回归方程为 Y=0 .980 X+0 .018, r2=0.990,稀释变异试验< P0.05;线性失控检查 G<F0.05,说明本法在2.0 mmol/L范围内线性良好。

二、临床应用

参考范围取正常对照组95%可信区间为(0.18±0.04)mmol/L。与正常对照组比较, CHD组血清RLP浓度明显升高( P< 0.01) ,而TC和LDL则无明显变化。RLP的临床符合率(79.7%)高于其他血脂指标。见 表3。

表3 CHD组和正常对照组RLP和其他血脂指标以及各指标临床浓度符合率的比较
讨 论

流行病学研究显示,在家族性高脂蛋白血症、糖尿病和代谢综合征中,富含TG的脂蛋白,特别是CM残余和VLDL残余会在血液循环中聚集。这些RLP正逐渐作为动脉粥样硬化的危险因素来进行重点研究[ 4]。由于RLP在血浆中迅速分解代谢,其分子大小、脂质和脂蛋白、代谢产物和代谢途径各不相同,难以用常规的生化技术分离定量,这使得RLP的研究受到限制。测定RLP的传统方法主要有超速离心法和凝胶电泳法,两者均需特殊仪器,费用昂贵,难于在临床实验室开展。近年来日本学者NaKajima等[ 5]报道的一种基于RLP中载脂蛋白成分的免疫特异性来分离RLP、然后结合酶法进行测定的免疫分离法被广泛应用。

本研究应用NCCLS的相关文件,对运用这种沉淀分离法的国产试剂进行了方法评价,结果表明此法具有较好的精密度,批内 CV为4.4 %,批间 CV为5.9 %;平均回收率为98.7 %;检测线性达2.0 mmol/L;Hb<5 g/L、Bil<300 μmol/L、TG<14.1 mmol/L时对RLP测定无明显干扰。该法试剂盒的稳定性良好,可以满足常规实验室的检测需要。这种测定方法的关键步骤在于免疫复合物的形成,因此试剂的质量将主要取决于前处理液。

CHD在我国发生率较高,且呈逐年上升趋势,在疾病发生过程中,胆固醇起着重要作用,TC和LDL是血脂指标中最主要的CHD致病因子,最近的研究发现RLP也是CHD等与动脉粥样硬化相关性疾病的重要危险因素[ 6, 7],并且血清RLP浓度与疾病的严重程度有一定的正相关[ 8]。本研究显示, CHD组血清RLP水平明显高于正常对照组( P< 0.01),而TC、LDL-C以及其他血脂指标则无明显变化。提示在CHD危险因素中,RLP比TC等相关性更强。可能机制为RLP来源于CM和VLDL,其组成以TG为主,所含胆固醇占血清比重较低,故血清RLP显著升高可能不足以引起TC等显著升高。本研究CHD患者都经过不同程度的干预治疗,包括饮食控制、调脂降压药物、戒烟等,血脂指标容易受到影响,而RLP由于受到的影响较小,可成为CHD的预后预测指标。此外,CHD患者多数为中老年人,且多伴有脂质代谢紊乱,在中、后期TC和LDL-C并无明显的升高,有的反而低于正常人群。有研究表明近半数CHD患者的血清TC水平在正常范围内,且TC水平过低能明显增加老年CHD患者的病死率[ 9],此时检测RLP的意义更大。RLP可作为新的CHD的脂质指标应用于临床。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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