引用本文
迟珊, 沈默, 张曼. γ-谷氨酰基转移酶国际室间比对计划结果分析. 26(8): 540-543
CHI Shan, SHEN Mo, ZHANG Man. Analysis of the RELA results of gamma-glutamyltransferase reference method. Labratory Medicine, 26(8): 540-543  
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γ-谷氨酰基转移酶国际室间比对计划结果分析
迟珊, 沈默, 张曼
首都医科大学附属北京世纪坛医院临床检验中心,北京 100038

通讯作者：张曼,联系电话：010-63926389。

作者简介：迟珊,1981年生,女,学士,技师,主要从事参考实验室工作。

基金:首发基金重大联合项目[北京市临床生化参考测量体系在社区的推广应用（2007-1044）; 北京市临床生化参考测量体系的建立及应用（2007-1045）;
摘要
目的

对2006~2008年参加国际临床化学联合会(IFCC)组织的参考实验室国际比对计划(RELA)的γ-谷氨酰基转移酶(GGT)测定结果进行比较和分析,为GGT参考方法的建立和应用提供借鉴。

方法

按照IFCC公布的酶学活性测定(37 ℃)参考方法的标准操作程序(SOP)测定GGT国际样本,不精密度评价按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP5-A2文件进行,准确度评价采用国际有证参考物质(ERM)。

结果

2006年测定结果:样本A为(1.829±0.021)μkat/L,样本B为(3.331±0.019)μkat/L;2007年测定结果:样本A为(1.533±0.017)μkat/L ,样本B为(3.840±0.035)μkat/L;2008年测定结果:样本A为(3.392±0.024)μkat/L ,样本B为(3.058±0.024)μkat/L。2006~2008年GGT参考方法的不精密度分别为1.29%、0.44%、0.65%,ERM测定均值在“靶值±不确定度”[(1.90±0.04) μkat/L]范围内,初步验证了参考方法的不精密度和准确度。

结论

2006~2008年RELA样本GGT测定结果均在IFCC公布的可信区间内,GGT的IFCC参考方法已经建立。

关键词: γ-谷氨酰基转移酶; 参考值; 评价研究; 临床酶试验
中图分类号:Q556 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)08-0540-04
Analysis of the RELA results of gamma-glutamyltransferase reference method
CHI Shan, SHEN Mo, ZHANG Man
Center of Clinical Laboratory , Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medicial University, Beijing 100038, China
Abstract
Objective

To compare and analyze the RELA [International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) external quality assessment scheme for reference laboratories in laboratorg medicine] results of gamma-glutamyltransferase (GGT) from the IFCC 2006-2008 in order to provide the reference for the establishment and application of GGT reference method.

Methods

The GGT levels of RELA samples were measured according to the standard operation procedure (SOP) (37 ℃) published by IFCC. The precision was evaluated according to the EP5-A2 document from National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), and the accuracy was evaluated by European reference materials (ERM).

Results

In RELA 2006, the result of sample A was (1.829±0.021) μkat/L, and the result of sample B was (3.331±0.019) μkat/L. In RELA 2007, the result of sample A was (1.533±0.017) μkat/L, and the result of sample B was (3.840±0.035) μkat/L. In RELA 2008, the result of sample A was (3.392±0.024) μkat/L, and the result of sample B was (3.058±0.024) μkat /L. The precisions of the year 2006, 2007 and 2008 were 1.29%, 0.44% and 0.65% respectively, and the results of ERM agreed with the certified value [target value±precision value: (1.90±0.04) μkat/L], which verified the precision and accuracy of the reference method.

Conclusions

All of the results of the 3 years agree to the confidence interval by IFCC. The GGT reference method has been established.

Keyword: Gamma-glutamyltransferase; Reference value; Evaluation study; Enzyme test

γ-谷氨酰基转移酶(γ-glutamyltransferase, GGT)作为重要的临床酶学检测指标之一,在诊断肝脏疾病方面有较高临床价值。GGT参考方法测定的影响因素较多,其中底物浓度、pH值、缓冲液种类和浓度、试剂纯度、孵育温度、加样器的精度以及测定延滞期、孵育时间和测定时间等诸多因素均可影响酶活性测定结果[ 1]。临床酶学检测结果的准确性和可比性是常规临床检验的基本需要,而参考方法是实现临床检验标准化的基础[ 2]。国际临床化学和实验室联合会(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)提出了包括肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、GGT及淀粉酶(AMY)在内的6种酶的37 ℃参考测定程序后,我国于2003年开始构建参考实验室网络,并从2006年开始组织参加由IFCC和德国临床化学和实验室协会(DGKL)组织的国际参考实验室室间比对计划(ring trial program,RELA),至今已形成了参考实验室网络雏形[ 4]。本参考实验室作为首批参与此计划的国内参考实验室之一,在2006~2008连续3年的比对中,在GGT的参考方法学建立以及性能评价方面积累了一定的经验。

材料和方法
一、材料

1.实验仪器 EVOLUTION 300型紫外分光光度计(美国Thermo公司,分光方式为后分光)。比色皿(美国Thermo 公司,光径为10 mm)。1521型点式温度计(美国Fluke 公司,精度0.001 ℃),pH计为意大利Hanna公司HI4212型(2006~2007年RELA使用)和瑞士Mettler Toledo公司SevenMulti型(2008年RELA使用)。稀释配液仪(瑞士HAMILTION MICROLAB 500series)。移液器(德国Eppendorf Reference公司)。电子天平(德国Sartorius公司)。

2.试剂 所有试剂均来自于美国Sigma公司,纯度为分析纯,配制方法完全依据IFCC公布的关于γ-谷氨酰基转移酶的测定参考方法(37 ℃)的标准操作程序(SOP)[ 3]。

3.实验样本 (1)有证参考物质(european reference materials,ERM):由欧共体参考物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements,IRMM)制备,用于GGT测定的批号为ERM-AD452/IFCC,复溶前保存于-80 ℃;(2)室内质控血清:使用Roche公司c.f.a.s作为室内质控品,用于重复性不精密度的测定,复溶前保存于4 ℃,复溶分装后冻存于-20 ℃,只允许冻融1次;(3)RELA样本:为冻干粉末,由DGKL提供,共有A、B 2个水平,测定前置于-80 ℃避光保存。

二、酶学参考测定方法

试剂配制、室内质控样本、ERM和国际比对样本的复溶及检测均完全参照IFCC提供的相关参考测定程序(37 ℃)。

三、统计学方法

使用SPSS13.0软件对不精密度、准确度以及RELA样本结果进行统计学分析,主要统计指标有均值( x- )、标准差( s)以及变异系数( CV)等。2006和2007年采用经典统计法处理结果数据;2008年采用稳健统计法处理结果数据,并用总统计量的 Z比分数对数据结果进行评价。| Z|≤2为满意结果;| Z|≥3为不满意结果,离群值,考虑剔除;2<| Z|<3为有问题结果,但不能随意剔除。对离群值的判断,通过公式 Z=( xn- x- ) /s进行计算。式中 xn为可疑极端结果; x- 为 n个结果的均值; s为 n个结果的标准差; n为测量次数,即测量结果数。

结 果
一、不精密度实验结果

参考美国临床实验标准化委员会(NCCLS)EP5-A2文件[ 5]。样本采用c.f.a.s进行测定, 共测定20 d,每天分2批测定, 每批之间时间间隔不小于2 h,每批均需测定试剂空白。本实验室GGT参考方法重复性不精密度结果2006年为1.29%,2007年为0.44%,2008年为0.65%。

二、准确度实验结果

ERM定值方法是采用国际12个已认证参考实验室测定结果的未加权平均数,结果可溯源至IFCC原级参考方法。用于GGT准确度测定的ERM标示值为(1.90±0.04)μkat/L,2007年和2008年ERM测定结果均在标示值±不确定度范围内。见 表1。

表1 2007年、2008年的ERM测定结果
三、2006年RELA结果

1. 测定值 2006年测定样本A、B各16批。样本A、B的测定值( x- ±不确定度)分别为1.829±0.021、(3.331±0.019) μkal/L, CV分别为1.14%、0.88%。

2. 偏倚 2006年结果回报样本A靶值为1.840 μkal/L,样本B靶值为3.354 μkal/L。本实验室样本A、B测定结果与靶值相比,样本A的偏倚为-0.011 μkal/L,相对偏倚为-0.598%;样本B的偏倚为-0.023 μkal/L,相对偏倚为-0.686%。

四、2007年RELA结果

1. 测定值 2007年测定样本A、B各12批。样本A、B的测定值( x- ±不确定度)分别为1.533±0.017、(3.840±0.035) μkal/L, CV分别为0.55%、0.45%。

2. 偏倚 2007年结果回报样本A靶值为1.532 μkal/L,样本B靶值为3.835 μkal/L。本实验室样本A、B测定结果与靶值相比,样本A的偏倚为0.001 μkal/L,相对偏倚为0.065%;样本B的偏倚为0.005 μkal/L,相对偏倚为0.130%。本年度结果的相对偏倚为3年中最小。

五、2008年RELA结果

1. 测定值 2008年测定样本A、B各30批。样本A、B的测定值( x- ±不确定度)分别为3.392±0.024、(3.058±0.024) μkal/L, CV分别为0.33%、0.37%。

2. 偏倚 2008年结果回报样本A靶值为3.483 μkal/L,样本B靶值为3.139 μkal/L。本实验室样本A、B测定结果与靶值相比,样本A的偏倚为-0.091 μkal/L,相对偏倚为-2.613%;样本B的偏倚为-0.081 μkal/L,相对偏倚为-2.580%。

讨 论

RELA是全球参考实验室应用参考方法对参考物质进行测定的比对计划。此计划旨在实现参考实验室测量的有效性,此比对计划的结果是参考实验室能力的有效体现。在RELA中,除需上报样本测定值及不确定度、 s值、测定方法等,未对参加此计划的参考实验室所用仪器型号、试剂品牌、加样方式等作硬性规定。而由于酶蛋白本身的生物学特点及其对催化反应条件的特殊要求,各参考实验室只能在反复试验过程中不断摸索出适合本实验室的酶学测定参考方法。

众所周知,酶学实验测定中,反应温度为保证结果准确性的关键因素。IFCC参考方法要求反应体系温度要控制在(37.0±0.1) ℃。本实验室使用半导体加热模块,此加热模块为单个反应杯并且配备有磁力搅拌装置,很利于温度的控制以及进行实时搅拌,能有效保证反应体系的稳定性。同时使用高精度的点式温度计插入比色皿内部对反应系统的温度进行实时监控,监控阶段每30 s记录反应液温度。需要指出的是,预实验阶段要确定点温度计探头在比色皿内的最佳位置,以保证所监控温度可以反映整个反应液的平均温度。反复实验证明,点温计探头的纵向位置,不仅与上中下三区有关,还受液面高度的影响,越接近液面位置温度越高。综合实验结果,我们选择点温度计探头位置在液面高度1/2,横截面的中心位置为最佳位置。此外,GGT参考方法测定中,由于样本和启动试剂(R2)的体积分数较大,容易在加入样本和启动试剂后导致反应体系的温度显著下降。因此要求操作人员快速准确的加样技术。

参考方法对于试剂纯度也有明确要求。由于甘氨酸是GGT的抑制剂,故在反应溶液甘氨酰甘氨酸中的甘氨酸杂质不应该超过0.1%,否则会导致GGT活性的下降。因此要选择明确标有纯度和成分的试剂,否则要明确试剂成分后方可使用。此外,本实验室经过反复实验发现,孵育时间过长会导致酶活性测定结果偏低,是由于GGT的总底物会有自体反应,因此要严格按IFCC参考方法控制孵育时间。

在国际样本正式测定之前,首先要经过不精密度实验和准确度实验进行参考方法的性能验证。不精密度实验结果严格依据EP5-A2文件进行评定,准确度实验结果应在ERM的标示值±不确定度范围内。2006年本实验室第1次参加RELA活动,处于摸索阶段,且为移液器手动加样,重复性不精密度为1.29%,略高于1%。2007年和2008年改为稀释配液仪加样,重复性不精密度均低于1%。2007年重复性不精密度结果为3年中最小,为0.44%;并且样本A的室内 CV由2006年的1.14%降至2008年的0.33%,样本B的室内 CV由2006年的0.88%降至2008年的0.37%,充分验证了本实验室参考方法的稳定性。此外2007年和2008年本实验室采用ERM进行准确度实验验证,测定结果均在标示值±不确定度范围内(见 表1),充分验证了本实验室参考方法的准确性。

在RELA计划中,评价参考实验室能力的重要标准是各参考实验室的室内 CV以及测定结果与靶值的偏倚和相对偏倚。RELA计划的组织者将靶值定义为所有参加RELA比对计划的实验室结果的平均值,并从2007年开始将靶值加减5.25%设定为可信区间。RELA结果回报分析方式为Youden图,此图较直观地反映出各参考实验室测定结果的靶值位置和不确定度范围。本参考实验室3年RELA测定结果与所有实验室均值(靶值)比较,本实验室均位于图中中心区域,2006年未设定可信区间,后2年均位于RELA设定可信区间内。从3年测定结果与靶值的相对偏倚也可以看出,2006年和2007年样本A、B的相对偏倚均较小。其中2007年样本A的相对偏倚最小(0.065%),2008年样本A、B的相对偏倚略有增高,且均为负数,考虑与分光光度计波长的准确性有关。因此实验前需要对分光光度计指定波长处透射比的准确性进行验证。

不确定度是表达测量的质量和能力的重要指标,其表征被测量值的分散性。但是由于权威部门对不确定度的评定标准在不断的变化中,因此难以确立统一的不确定度评定标准。各实验室在不断摸索自己的不确定度评定标准的同时,本实验室的不确定度评定标准也在不断地改进中。由于酶促反应中实际的摩尔吸光系数与理论值的偏差、温度及湿度变化、分光光度计波长的准确性和光度噪声,甚至试剂的纯度、批号等因素均可影响测定结果。如何对这些分量进行评价,并通过统计学方法将其量化为不确定度,需要进一步的分析研究。

综上所述,本参考实验室通过连续3年参加IFCC组织的RELA活动,对GGT等酶的参考方法已经进行了初步验证,并与国内其他参考实验室作为参考实验室网络在技术水平上与国外同类实验室水平相当。今后本实验室将主要通过继续参加国内外的方法间比对等方式,对参考方法性能进行进一步的论证和维持,同时参加标准物质的研制及申报、质控物或校准物互通性的评价以及对常规方法综合分析评价等工作。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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