引用本文
程茂玲, 乔刚. 青岛地区肾综合征出血热病毒基因分型. 26(8): 523-526
CHENG Maoling, QIAO Gang. Analysis of the genotyping of hantavirus in Qingdao. Labratory Medicine, 26(8): 523-526  
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《检验医学》编辑部
青岛地区肾综合征出血热病毒基因分型
程茂玲, 乔刚
胶南市人民医院,山东 胶南 266400

作者简介：程茂玲,女,1964年生,学士,主管技师,主要从事临床检验及微生物检验工作。

摘要
目的

调查青岛地区肾综合征出血热病毒的流行情况,研究病毒在该地区的分子流行病学特征及基因分型。

方法

采集64例肾综合征出血热(HFRS)急性期患者血清标本,提取血清中病毒RNA作为模板。根据GenBank中汉坦病毒基因序列,设计HTN型和SEO型的通用外套引物,同时分别设计HTN型特异性引物和SEO型的特异性引物作为内套引物。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增汉坦病毒基因组M片段G1区基因序列并测序。测序结果利用DNA Star软件进行核苷酸序列分析。

结果

在64例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性6例,占9%;用SEO型特异性引物扩增阳性25例,占39%;总阳性率为48%。总体来看,青岛地区流行的汉坦病毒以SEO型为主。SEO型汉坦病毒间核苷酸序列的差异相对较小,在核苷酸序列水平其基因的离散度为0.3%~8.9%。HTN型汉坦病毒的变异率较高,其基因的离散度为2.6%~11.2%。

结论

青岛地区汉坦病毒的流行以SEO型为主,HTN型并存,其中HTN型主要发生在胶南市。

关键词: 汉坦病毒; HTN型; SEO型; M区基因; 基因分型
中图分类号:R373.9 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)08-0523-04
Analysis of the genotyping of hantavirus in Qingdao
CHENG Maoling, QIAO Gang
Jiaonan People's Hospital, Shandong Jiaonan 266400, China
Abstract
Objective

To research the epidemic circumstance and investigate the molecular epidemiological characteristics and genotyping of hantavirus in Qingdao area of Shandong Province.

Methods

The 64 serum samples were collected from patients of hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS), and the virus RNA was extracted as pattern. According to the hantavirus gene sequence of GenBank, HTN and SEO universal primers were designed as outer primers, and HTN and SEO specific primers as inner primers.G1 gene sequence of M fragment from hantavirus genome was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and analyzed. DNA Star software was used to analyze nucleic acid sequence.

Results

Six(9%) cases were positive with HTN specific primer, and 25(39%) cases were positive with SEO specific primer. The total positive rate was 48%.SEO type was prevalent in hantavirus epidemiology in Qingdao. The variation of the nucleotide sequences among SEO type (nucleotide sequence divergence ranging from 0.3%-8.9%) was lower than that among HTN type (nucleotide sequence divergence ranging from 2.6%-11.2%).

Conclusions

Most isolates of hantavirus are SEO type, while HTN type exists also in Qingdao.Most HTN isolates are detected at Jiaonan area.

Keyword: Hantavirus; HTN type; SEO type; M region gene; Genotyping

汉坦病毒(Hantavirus)是肾综合征出血热(HFRS)的主要病原体,在全世界广泛分布,但在不同地区存在的汉坦病毒型别不完全相同。既往的研究资料显示,截止到2002年11月,我国仅存在HTN型(宿主为野生黑线姬鼠)和SEO(宿主为褐家鼠)2个型别的汉坦病毒[ 1]。我国是受汉坦病毒流行危害最为严重的国家,在全国32个省、自治区、直辖市中29个有出血热的病例报道,每年报告的病例平均约有4~6万,占世界发病总数的90%以上,其中HTN和SEO型汉坦病毒的人类感染更是绝大多数发生在我国[ 2]。山东省是我国出血热的主要疫区。自1989年以来,山东省的HFRS发病人数居全国首位,流行范围涉及全省的各个地、市,病死率较高。其中青岛地区(尤其是胶南市、平度市、莱西市等)是山东省汉坦病毒感染的高发区。我们应用分子生物学技术对青岛地区汉坦病毒流行株的基因进行分型,并对病毒M基因片段G1区部分核苷酸序列进行分析,旨在积累流行病学资料,为该地区流行性出血热病毒疫苗的研制奠定基础。

材料和方法
一、标本采集

根据山东省青岛地区多年汉坦病毒的流行特点,收集胶南市、平度市、胶州市、莱西市、即墨市各医院HFRS急性期血清标本64份,血清均经兰州生物制品研究所生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒检测确证。

二、血清中病毒RNA提取

取500 μL血清标本加入等体积Trizol试剂(Invtrogene公司)和100 μL的氯仿混合,13 000 r/min(离心半径为8 cm)离心,将上层水相转入一新管,加入等体积异丙醇沉淀RNA。干燥后加入10 μL用DEPC处理去离子水溶解RNA沉淀,-80 ℃保存备用。

三、引物的设计与合成

根据GenBank中汉坦病毒基因序列,设计P1和P2为HTN型和SEO型的通用外套引物,设计P3和P4为HTN型特异性内套引物,P5和P6为SEO型内套引物。引物序列P1:ATACGTAYTGACTGTTGN AGTCATGA (nt1910-1939);P2:TCCAGCTAGTATCGT ATAGYAC (nt2354-2373);P3:GCACTTGGATTGCA TCCGAAG(nt1958-1984);P4:GAGACGAGCTGGGTT GTCCA(nt2318-2340);P5:AATAATGAGTATGGC TTAT(nt1936-1957);P6:GCGTTAGTCGTACTG ATGAT(nt2331-2353)。以上引物均由上海生物工程公司合成。

四、目的基因的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增

以Random 9mers为引物,利用Promega公司生产的Reverse Transcription System Kit将提取的血清标本RNA逆转录为cDNA。再以cDNA为模板,P1、P2作为引物行外套PCR扩增,再分别用HTN和SEO型特异性引物作为内套引物,外套PCR产物为模板行内套PCR扩增。PCR的反应条件为:94 ℃预变性2 min,然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,最后72 ℃延伸10 min。取内套PCR的扩增产物5 μL,于含溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶上电泳30 min,在紫外线透射仪下观察,并与PCR Marker比较。

五、 PCR产物的克隆和序列测定

内套扩增的PCR产物经Promega公司生产的PCR产物纯化试剂盒(Wizard PCR preps DNA purification system)纯化后,与Promega公司的T-vector试剂盒(Wizard T-easy vector system)中的Pgem-T载体连接,连接后的重组质粒转化大肠埃希菌(JM109),转化后的宿主菌送往上海生工公司,利用该公司的ABIDNA737型自动测序仪进行核苷酸序列测定。

六、 序列分析

将测序结果用DNA Star软件分别进行分析,比较其离散度。

结 果
一、套式RT-PCR扩增标本PCR产物电泳

用HTN型特异性引物扩增出的内套阳性PCR产物电泳后同PCR Marker相比,在250~500 bp之间,略接近500 bp的位置有1条DNA条带。用SEO型特异性引物扩增出的内套阳性的PCR产物电泳后同PCR Marker相比,在250~500 bp之间,略接近500 bp的位置有1条DNA 条带。见 图1。

图1 部分血清RT-PCR扩增结果

二、分子生物学分型

64份标本利用套式RT-PCR进行分子生物学分型,其中阳性结果为31份,总阳性率为48%。通过基因分型,64份标本中用HTN型特异性引物扩增阳性6份,占9%;用SEO型特异性引物扩增阳性25份,占39%。

三、SEO型标本核苷酸序列分析

使用SEO型特异性引物扩增出阳性标本共25份。利用DNA Star软件对排结果表明,此25份SEO型标本测序部分核苷酸序列的离散度在0.3%~8.9%之间,核苷酸的离散度较低,见 图2。

图2 25株SEO型汉坦病毒的亲缘关系树

四、HTN型标本核苷酸序列分析

使用HTN型特异性引物扩增出阳性标本6份。除HTN6测序为344 bp,有一个碱基缺失外,其余测序均为345 bp。利用DNA Star软件对排结果表明,此6份HTN型标本测序部分核苷酸序列的离散度为2.6%~11.2%,见图3。

图3 6株HTN型汉坦病毒的亲缘关系树

讨 论

基因分型研究(RT-PCR技术及核苷酸序列测定)已成为汉坦病毒分型研究的主要方法[3~ 5]。汉坦病毒基因组由L、M、S 3个独立分段的RNA片段组成。其中M片段G1基因区核苷酸序列在不同株间有较大的差异。汉坦病毒M片段基因编码包膜蛋白G1和G2。不同型别汉坦病毒M片段核苷酸序列有明显差异,且G1和G2的同源性比较,G1差异比较大,可能是病毒糖蛋白上型特异性抗原决定簇所在[ 6],此区域是进行汉坦病毒基因变异和分型的主要区域。根据国内外相关文献报道,本研究选取了应用较多的M基因区域(2 000~2 300 nt),设计SEO型和HTN型病毒通过引物和型特异性引物,使用RT-PCR技术来提高扩增检测的特异性和敏感性。本研究收集了来源于山东省青岛地区主要疫源地胶州市、胶南市、平度市、莱西市、即墨市HFRS患者血清标本,对其汉坦病毒分布和分型进行了确证。总体看来,青岛地区是以SEO型汉坦病毒为主、HTN型并存的混合疫区。其中HTN型主要出现在胶南市,这对有针对性注射疫苗保护易感人群具有重要意义。此外,本研究结果显示,SEO型的汉坦病毒较为保守,各株之间的变异较小。无论是SEO型和HTN型,病毒的分布呈地区聚集现象。也就是说,来源于地理位置较近的病毒株显示出较高的基因组核苷酸序列的同源性。该研究结果与国内外相关报道一致,提示该疫区存在着优势汉坦病毒基因型(SEO型),这可能是由汉坦病毒与该疫区的优势自然宿主共同进化造成的[ 7]。

本研究不仅累及了青岛地区汉坦病毒的分子流行病学资料,对汉坦病毒进行了基因分型,分析了毒株间核苷酸序列的变异,同时为研制快速检测诊断试剂及分型检测试剂及基因工程疫苗奠定了理论基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 姚智慧, 罗兆庄, 俞永新, 等. 汉坦病毒汉滩型特殊新亚型的发现[J]. 病毒学报, 2001, 17(3): 215-220. [本文引用:1]
[2] 白雪帆, 黄长形. 进一步加强肾综合征出血热的研究[J]. 中华传染病杂志, 2002, 20(4): 197-198. [本文引用:1]
[3] 李盈盈, 杭天寿, 刘旭, 等. 聚合酶链反应技术在肾综合征出血热病毒基因分型中的应用[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1994, 8(1): 20-25. [本文引用:1]
[4] Plyusnin A, Mustonen J, Asikainen K, et al. Analysis of puumala hantavirus genome in patients with nephropathia epidemica and rodent carriers from the sites of infection[J]. J Med Virol, 1999, 59(3): 397-405. [本文引用:1] [JCR: 2.373]
[5] Chin C, Chiueh TS, Yang WC, et al. Hantavius infection in Taiwan: the experience of a geographically unique area[J]. J Med Virol, 2000, 60(2): 237-247. [本文引用:1] [JCR: 2.373]
[6] Parrington MA, Lee PW, Kang CY. Molecular charac-terization of the prospect hill virus mRNA segment: a comparison with the mRNA segments of other hantavirus[J]. J Gen Virol, 1991, 72(Pt 8): 1845-1854. [本文引用:1] [JCR: 3.127]
[7] 解燕乡, 杭天寿. 汉坦病毒与自然宿主动物共进化及实验动物模型的研究进展[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2000, 14(2): 99-100. [本文引用:1]