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张丽萍, 郝钦芳, 刘元明, 宋娜, 张丹浩, 李晓晨, 谭坤, 杨晓莉. 酶增强免疫分析法与微粒子酶联免疫吸附法检测他克莫司药物浓度的结果对比研究. 26(8): 501-505
ZHANG Liping, HAO Qinfang, LIU Yuanming, SONG Na, ZHANG Danhao, LI Xiaochen, TAN Kun, YANG XiaoLi. The result comparison research of the tacrolimus concentration by enzyme-multiplied immunoassay technique and microparticle enzyme immunoassay. Labratory Medicine, 26(8): 501-505  
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酶增强免疫分析法与微粒子酶联免疫吸附法检测他克莫司药物浓度的结果对比研究
张丽萍, 郝钦芳, 刘元明, 宋娜, 张丹浩, 李晓晨, 谭坤, 杨晓莉
武警总医院检验科,北京 100039

通讯作者：杨晓莉, 联系电话：010-57976749。

作者简介：张丽萍, 女, 1975年生, 学士, 主管技师, 主要从事移植后药物浓度监测及自身免疫性疾病的研究。

摘要
目的

对酶增强免疫分析法(EMIT)与微粒子酶联免疫吸附法(MEIA)进行比对实验,评估SYVA Viva-E临床化学分析仪(简称SYVA Viva-E)和Abbott IMX分析仪(简称Abbott IMX) 2种检测系统测定他克莫司(FK506)药物浓度的一致性。

方法

将Tac/Csa CONTROL质控品分别用SYVA Viva-E(EMIT)和Abbott IMX(MEIA)进行批内、批间精密度测定。FK506的靶值(检测范围):A1水平为4.3(2.1~6.5)ng/mL、A2水平为8.9(5.3~12.5)ng/mL、A3水平为18.0(14.0~22.0)ng/mL。将158份临床患者样本分为极低浓度(0.1~<2.0 ng/mL)、低浓度(2.0~<8.0 ng/mL)、中浓度(8.0~<14.0 ng/mL)、高浓度(14.0~<20.0 ng/mL)和极高浓度(20.0~24.0 ng/mL)5个组,用SYVA Viva-E和Abbott IMX平行测定FK506浓度,观察2种检测系统测定临床样本的相关性。

结果

当FK506浓度处于A1水平时,SYVA Viva-E的批内、批间精密度及检测结果均值均高于Abbott IMX(P<0.05);处于A2、A3水平时,2种检测系统批内、批间精密度及检测结果均值相近,差异无统计学意义(P>0.05)。Abbott IMX的检测精密度优于SYVA Viva-E。当临床样本浓度<8.0 ng/mL时,SYVA Viva-E检测结果的均值比Abbott IMX约高1.0 ng/mL,二者比较差异有统计学意义(P<0.01),与测定质控品的结果一致;当样本浓度≥8.0 ng/mL时,SYVA Viva-E检测结果的均值与Abbott IMX相近,二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。2种检测系统测定临床样本的总体相关性较好(r=0.977),但SYVA Viva-E检测结果均略高于Abbott IMX。

结论

应用EMIT检测FK506时,其检测结果略高于MEIA,尤其在低浓度范围更加明显。2种检测系统在检测FK506浓度时可能存在系统偏差。

关键词: 酶增强免疫分析法; 微粒子酶联免疫吸附法; 他克莫司
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)08-0501-05
The result comparison research of the tacrolimus concentration by enzyme-multiplied immunoassay technique and microparticle enzyme immunoassay
ZHANG Liping, HAO Qinfang, LIU Yuanming, SONG Na, ZHANG Danhao, LI Xiaochen, TAN Kun, YANG XiaoLi
Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Armed Police Forces, Beijing 100039, China
Abstract
Objective

To evaluate the coincidence of the results of tacrolimus (FK506) concentration determined by enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) using the SYVA Viva-E clinical biochemical analyzer (SYVA Viva-E) and by microparticle enzyme immunoassay (MEIA) using the Abbott IMX analyzer (Abbott IMX).

Methods

The within-run and between-run precisions were detected with quality control material Tac/Csa by SYVA Viva-E (EMIT) and by Abbott IMX (MEIA). The FK506 target values as determination range were A1=4.3(2.1-6.5)ng/mL, A2=8.9(5.3-12.5) ng/mL and A3=18.0(14.0-22.0) ng/mL. 158 clinical samples were collected as clinical sample group and were classified into 5 concentration groups: extremely low concentration (0.1-<2.0 ng/mL), low concentration (2.0-<8.0 ng/mL), middle concentration (8.0-<14.0 ng/mL), high concentration (14.0-<20.0 ng/mL) and extremely high concentration (20.0-24.0 ng/mL). SYVA Viva-E and Abbott IMX were used to determine the FK506 concentration of equal rank. The correlation of the 2 analyzers detecting clinical samples was observed.

Results

In the A1 concentration range, the within-run and between-run precisions and the average results by SYVA Viva-E were both higher than those by Abbott IMX (P<0.05). In the A2 and A3 concentration ranges, the within-run and between-run precisions and the average results by SYVA Viva-E were closed to those by Abbott IMX with no significant difference (P>0.05). The precision by Abbott IMX was better than that by SYVA Viva-E. In the clinical sample group, when the concentration was <8.0 ng/mL, the average result by SYVA Viva-E was higher about 1.0 ng/mL than that by Abbott IMX, and it had significant difference (P<0.01). The result was consistent with that of the control group. When the concentration was≥8.0 ng/mL, the average result by SYVA Viva-E was closed to that by Abbott IMX, and it had no significant difference (P>0.05). The overall correlation coefficient of the result was good (r=0.977), but the result by SYVA Viva-E was slightly higher than that by Abbott IMX.

Conclusions

The FK506 result by EMIT is slightly higher than that by MEIA, especially in the low concentration range. The FK506 results by 2 detection systems possibly have system error.

Keyword: Enzyme-multiplied immunoassay technique; Microparticle enzyme immunoassay; Tacrolimus

他克莫司(tacrolimus FK506),其商品名又称普乐可复(pullock rcusable),是一种大环内酯类强效免疫抑制剂,因其副作用小、抑制作用强、低死亡率、高移植存活率等优点,在临床器官移植的抗排斥作用中应用日趋广泛[ 1]。但FK506治疗窗窄,而且个体差异较大,浓度过高易致肾毒性和高血糖发生,过低又易并发急性排斥反应[ 2]。所以器官移植术后定期监测FK506药物浓度并及时调整用药剂量,对充分发挥FK506的免疫抑制作用,避免或减少不良反应非常重要。国内临床上常用Abbott IMX分析仪(简称Abbott IMX)检测FK506、西罗莫司等药物浓度,以前的检测方法多为微粒子酶联免疫吸附法(microparticles enzyme immunoassay, MEIA)。关于Abbott IMX方法学评价的报道也较多。但随着Abbott IMX分析仪退出市场,寻找一种结果可靠、操作简便,与Abbott IMX结果相关性好的替代仪器,也成为现在Abbott IMX用户的当务之急。西门子公司的SYVA Viva-E临床化学分析仪(简称SYVA Viva-E)运用酶增强免疫分析法(enzyme-multiplied immunoassay tecbniquem,EMIT)检测FK506浓度,因其自动化程度高、样本用量少,样本预处理简单、快速,并且适用急诊和大样本分析测定等优点,现国内应用较多。我们通过2种检测系统测定质控品的精密度及临床样本的对比分析,评估2种检测系统测定FK506药物浓度的一致性。

材料和方法
一 、仪器

1.SYVA Viva-E 由西门子公司生产,采用EMIT检测全血FK506浓度。8R109UL Emit®R2000 FK506定标液、8R079UL Emit®R2000 FK506样本前处理试剂、Tac/Csa CONTROL多水平全血质控品及甲醇(美国化学学会试剂,HPLC级)均由西门子医学诊断产品(上海)有限公司提供。

2.Abbott IMX 由Abbott公司生产,采用MEIA检测全血FK506浓度。FK506校标液、质控品、Mode1、沉淀剂均为美国Abbott制药公司产品。

3.其他 VORTEX5振荡仪为江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品;Centrifuge 5424D台式离心机为德国Eppendorf公司产品。

二、材料

1.试剂 SYVA Viva-E检测试剂盒批号为8R019UL-B2。Abbott IMX检测试剂盒批号为69626M100。

2.质控品 由MORE DIAGNOSTICS提供的Tac/Csa CONTROL质控品(批号5255)FK506靶值(检测范围):A1水平为4.3(2.1~6.5) ng/mL;A2水平为8.9(5.3 ~ 12.5) ng/mL;A3水平为18.0(14.0~22.0) ng/mL。

3.临床样本筛选标准 选择2009年1月10日至1月30日之间行肝或肾移植术后的临床患者样本,或者为肝、肾移植术后3个月以上门诊随访患者的临床样本。样本需在服药前采集,检测结果为药物谷浓度。采用EDTA-K2抗凝,无凝集现象。样本采集后,即刻用Abbott IMX分析仪检测FK506,在室内质控在控情况下,选取检测结果最低值为≥0.1 ng/mL、最高值为≤24.0 ng/mL的临床样本。共入选临床样本158份。

5.临床样本分组 根据Abbott IMX检测结果,将FK506浓度为0.1~<2.0 ng/mL的32例样本设为极低浓度组;2.0~<8.0 ng/mL的34例样本设为低浓度组;8.0~<14.0 ng/mL的30例样本设为中浓度组,14.0~<20.0 ng/mL的32例样本设为高浓度组,20.0~24.0 ng/mL的30例样本设为极高浓度组。

三、方法

严格按照SYVA Viva-E试剂说明书和Abbott IMX试剂说明书对质控品和临床样本进行样本前处理和检测。

1.SYVA Viva-E批内精密度( CV)测定 取A1水平的质控品前处理4次。将上清液倒入同一试管中,充分混匀,用SYVA Viva-E连续检测15次,计算批内 CV。按同样方法检测A2和A3水平的质控品,记录并计算其批内 CV。

2.Abbott IMX批内 CV测定 把A1水平的质控品前处理15次。离心后取上清液倒入同一试管中,充分混匀后,再分别放在15个Abbott IMX专用纤维杯中,用Abbott IMX连续检测15次,计算其批内 CV。按同样方法检测A2和A3水平的质控品,记录并计算其批内 CV。

3.批间(日间) CV测定 每天上、下午分别用SYVA Viva-E和Abbott IMX平行复管检测1次A1、A2、A3水平的质控品,连续检测5 d,计算SYVA Viva-E和Abbott IMX检测的批间 CV。

4.临床样本测定 将Abbott IMX检测后符合入选标准的血样即刻用SYVA Viva-E做平行检测,对照Abbott IMX和SYVA Viva-E检测结果,观察各组检测结果的差异,计算及比较各组的相关系数( r)及总的 r值。

结 果
一、2种检测系统在质控品浓度范围内的批内、批间 CV比较

当FK506处于质控品A1水平(即4.3 ng/mL左右)时,2种检测系统的批内、批间 CV差异均有统计学意义( P<0.05),SYVA Viva-E的检测结果均值比Abbott IMX高约1.0 ng/mL。当FK506处与质控品A2、A3相同水平(即8.9~18.0 ng/mL)时,2种检测系统之间的批内、批间 CV相近,二者比较差异无统计学意义( P> 0.05);并且SYVA Viva-E和Abbott IMX的结果均在靶值附近。见 表1。

二、2种检测系统检测临床患者样本的比较

当样本浓度范围处于极低浓度和低浓度水平时(即< 8.0 ng/mL),SYVA Viva-E 检测结果的均值比Abbott IMX高约1.0 ng/mL,二者比较差异有统计学意义( P<0.01),与测定质控品得出的结果一致。当样本浓度处于中浓度以上范围时(即≥ 8.0 ng/mL),SYVA Viva-E检测结果的均值与Abbott IMX相近,二者比较差异无统计学意义( P> 0.05)。见 表2。158份临床样本结果的总体相关性较好( r=0.977),见 图1。

表1 SYVA Viva-E和Abbott IMX批内、批间精密度比较
表2 SYVA Viva-E和Abbott IMX检测临床患者样本组结果的比较

图1 SYVA Viva-E和Abbott IMX测定158份临床样本的相关性

讨 论

目前,FK506浓度检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、MEIA、高压液相色谱法(HPLC)、高效液相串联质谱法(HPLC/MS)和EMIT等[ 3]。国内常用Abbott IMX检测FK506浓度,其测定原理是将样本中FK506作为抗原,与试剂中带有抗体的微粒体结合,再和带有碱性磷酸酶的抗体结合,形成抗体-抗原-碱性磷酸酶复合物。该复合物上的碱性磷酸酶能使无荧光的4-甲基伞花基磷酸酯(MUP)水解成有荧光的4-甲基伞形酮(UP),从而根据所测荧光强度的变化率计算FK506的浓度。随着Abbott IMX退出市场,应用EMIT的SYVA Viva-E正逐渐被临床接受并应用,SYVA Viva-E的检测原理是将样本中FK506与酶试剂中标记有重组酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(rG6PDH)的他克莫司竞争,活性(游离)的rG6PDH将抗体试剂中的氧化型烟酞胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)转化为还原型烟酞胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),致使动态吸光度改变,计算出FK506的浓度。

国外有关于MEIA与EMIT的对比研究报道认为2种方法所测得结果相似,可相互替代,但EMIT在检测数量和检测时间上更优于MEIA[ 4]。国内实验室的水平与国外相比可能会有一些的差异,所以国外的试验研究成果是否适用于国内还需国内实验室再研究、试验。本研究就常用的MEIA与EMIT进行检测结果的比对研究,比较在国内实验室环境下,不同检测系统、检测方法检测FK506浓度的相关性。

由MORE DAGNOSTICS提供的Tac/Csa CONTROL质控品共有4个浓度水平。由于器官移植术后及术后3个月以上的患者FK506药物浓度常处于低、中浓度范围[ 5],故只选用前3个浓度水平进行试验。为了使临床患者的结果可以验证质控品的结论,临床样本组的浓度分组标准基本按照质控品浓度分组,并且分组更细化。在对2种检测系统精密度测定及临床样本比对试验中,SYVA Viva-E所用的试剂是同一盒,试剂开盖稳定时间为12周;Abbott IMX所用的是同一批号的2盒试剂,试剂均在有效期内。

本研究显示质控品在A2、A3水平时,2种检测仪器批内、批间精密度相近。临床患者样本浓度≥8.0 ng/mL 时,SYVA Viva-E的检测结果与Abbott IMX相近,但 SYVA Viva-E的结果均略高于Abbott IMX。当FK506处于低浓度水平时,即临床患者样本检测浓度为2.0~<8.0 ng/mL时, SYVA Viva-E的检测结果比 Abbott IMX高大约1.0 ng/mL,二者差异有统计学意义( P<0.01)。当FK506处于极低浓度(0.1~<2.0 ng/mL)时,SYVA Viva-E与Abbott IMX的检测结果相关性较差( r=0.537)。在SYVA Viva-E检测试剂说明书中明确提到,该仪器检测FK506的分析灵敏度为2.0 ng/mL,在2.0~30.0 ng/mL范围内呈线性关系。所以在实际工作中,当SYVA Viva-E的检测结果≤2.0 ng/mL时,建议该检测结果仅作参考,并持续动态监测该患者的FK506浓度。从总体水平来看,虽然2种检测系统的总体相关性非常好,但SYVA Viva-E的检测结果均略高于Abbott IMX,说明2种检测系统之间可能存在系统偏差。

Abbott IMX与SYVA Viva-E的检测结果有差异,一方面与2种仪器的检测原理有关,虽然2种检测系统均以样本中的FK506作为抗原,但检测方法不同。Abbott IMX是根据抗原抗体结合后所产生的荧光强度计算FK506浓度;而SYVA Viva-E是根据抗原抗体结合后酶活性的多少计算FK506浓度。另一方面,当样本中某些物质具有与待测药物相同的抗原表面标志时,可导致抗体与那些化学结构相近于母体的代谢产物、样本中的内源性物质产生交叉反应,其结果也会出现偏差[ 6]。最后,2种系统间的偏差不能排除环境因素的影响。国内有研究报道[ 7],运用EMIT检测FK506浓度时,实验室环境温度对测定结果的影响非常显著。当定标温度与检测样本温度相差2 ℃以上,测定结果有明显差异,虽然本研究中以室内质控严格筛选临床样本,并严密监测室温,但仍不能避免环境温度有轻微的变化。

总之,SYVA Viva-E (EMIT)和Abbott IMX (MEIA)检测全血FK506浓度时,结果总体相关性良好,但两者之间存在差异,尤其在低浓度时更加明显。检测FK506浓度的金标准为HPLC法,因目前没有条件做进一步的研究,所以这2种检测方法那一种更接近真值还有待于继续研究。我们建议当临床实验室用SYVA Viva-E替代Abbott IMX检测FK506时,≤2.0 ng/mL时的检测结果仅供参考。尤其是门诊随诊患者在动态监测FK506浓度时,临床医生或患者应尽量选择在同一实验室、同一检测系统上进行监测,并且不以1次的检测结果作为临床调药的依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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