HBV是目前已知最小的DNA病毒,基因组结构十分特别。环状部分的双螺旋DNA,由长度约3.2 kb(3 200个脱氧核苷酸碱基)并带有部分环状结构的双螺旋DNA组成,其中基因组中含有4个开放读码框(open reading frame,ORF)区,编码至少8种不同功能的蛋白。4个ORF分别为编码病毒核壳蛋白的C区、编码包膜蛋白的S区、编码病毒聚合酶的P区及编码病毒X蛋白的X区。在S基因前面的2个小的ORF,编码2种S蛋白相关的抗原(HBsAg的各类亚型蛋白体),这2种抗原也存在于病毒颗粒的表面,分别称为前S1(PreS1)和前S2(PreS2)^{[ 3]}。另一方面,根据HBsAg的基因核苷酸序列又可将HBV分成8个主要的基因型,即A~H。我国HBV基因型在南方以B型为主,北方以C型为主,D型仅见于西部及少数民族地区,A型和F型偶有发现。也有学者研究发现在我国宁夏地区、广东地区和香港地区D基因型约占感染者的15%。近年有报道在我国西南地区鉴定出一个新的HBV基因型I^{[ 4]}。

HBsAg由S基因编码。根据HBsAg表面抗原决定簇的不同,可将HBV分为不同的血清型及其亚型。共同抗原决定簇a由S基因编码的第124~147位氨基酸所决定,存在于各型HBsAg,而以S区的122位的赖/精氨酸判定d/y的特异性,以160位的赖/精氨酸判定w/r的特异性,构成d/y、w/r 2对互斥的亚型决定簇^{[ 5]}。当a分别与2对d/y、w/r决定簇结合可以进一步细分为不同的亚型,亚型w和r还可以进一步细分,w分为w1~4,r分为r、rq⁺和rq^-。目前共发现4种HBV血清型(10种亚型),即adw(adw2、adw4、adw4q^-),ayw(ayw1、ayw2、ayw3、ayw4),adr(adrq⁺、adrq^-)和ayr。研究发现不同血清亚型可属于同一基因型,而同一血清亚型可分布于不同基因型,但HBV血清亚型和基因型之间有一定的相关性,但并非绝对一一对应,即 A型(adw2、ayw1),B型(adw2、ayw1),C型(ayr、adrq、adrq^-、adw2),D型(ayw2、ayw3),E型(ayw4),F型(ayw4、adw2、adw4q^-),G型(adw2),H型(adw3)。

HBsAg的共同抗原决定簇a几乎存在于所有的HBsAg血清型中,这一特点使得这一共同抗原决定簇a成为了疫苗和诊断的最佳靶点。HBsAg共同抗原决定簇a的内部氨基酸或其S基因编码区相邻氨基酸的突变可能导致HBsAg抗原性改变,从而导致这些突变抗原无法被市场上现有的HBsAg检测试剂盒所识别。这些突变体中最主要的是G145R(第145位的甘氨酸变成精氨酸)和K141E(第141位的赖氨酸变成谷氨酸)突变,他们可以显著影响HBsAg的抗原结构^{[ 6]}。因此,在不影响检测敏感性的前提下,开发既能够鉴定HBsAg不同亚型同时又可以有效识别HBV突变体的检测试剂是目前国际上体外诊断(IVD)研发机构和诊断试剂公司面临的新挑战。

当前我国HBV检测的HBsAg、抗HBs、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(抗HBe)和乙型肝炎核心抗体(抗HBc)(IgG/IgM)等指标是临床诊断中主要的HBV感染血清标志物。在多年的实际应用中,这些指标的可靠性得到了验证,同时也不断产生新的问题。如乙型肝炎流行病学的调查,HBsAg检测标准的建立,如何检测HBsAg亚型和HBsAg突变体,如何解决由HBV前C区1 896位发生由鸟嘌呤→腺嘌呤的突变产生终止密码子、阻断完整的HBeAg表达而导致基于抗原-抗体反应的常规的免疫试剂无法检出突变的HBeAg^{[ 7]}等,这些都是提高HBV感染预防和诊断水平必须面对的重大问题。

1.HBsAg检测现状 HBsAg的检测方法主要是基于抗原-抗体反应而开发出各种诊断试剂盒,如琼脂凝胶沉淀法、血球凝集法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫试纸法、免疫化学发光法和蛋白芯片检测法等。不管何种检测方法,试剂的特异性和敏感性是2个最关键的问题。然而HBV的复制特点决定了其具有较高的突变频率,HBsAg的S基因序列中的点突变导致病毒HBsAg的结构变化,致使利用抗原-抗体反应的免疫试剂无法检测其突变抗原。

2. HBV的S基因突变对乙型肝炎计划免疫的潜在威胁 一项针对我国东部地区5 407个0~8周岁儿童进行的调查研究表明,儿童的HBV主要感染类型为基因型C、血清型adr,他们的主要突变I126T(第126位的异亮氨酸变成苏氨酸)、第137位氨基酸突变(第553个核苷酸缺失突变)、G145A(第145位的甘氨酸变成丙氨酸)、G145R(第145位的甘氨酸变成精氨酸)和F158S(第158位的苯丙氨酸变成丝氨酸)等,其中第137位和第158位的氨基酸突变在此之前尚无报道。突变株的流行率为14%(7/51)^{[ 8]}。若对这些突变株缺乏有效的检测,可能导致这些突变株在免疫人群中传播,从而对全国范围内实行的乙型肝炎免疫效果产生潜在的威胁。因此,了解我国HBV基因型和HBsAg血清型的流行特点,对乙型肝炎疫苗的制备有很重要的参考价值。由于存在HBV混合感染情况,制备HBV疫苗时需要考虑选用HBsAg优势血清型或其亚型作为疫苗抗原。

3. HBsAg血清型及其亚型与酶联免疫检测HBsAg试剂研制的新思路 在世界范围内,对70个HBsAg酶联免疫分析试剂盒有效性和敏感性检验的研究中发现,17种诊断试剂具有良好的敏感性,可以达到<0.13 IU/mL,并且对突变体的检出率为100%,说明这些诊断试剂的抗原抗体结合位点不在其突变位点;另有6种对于某些HBV突变型表现出相对低的敏感性,甚至不能检出(极易漏诊);20种酶联免疫分析试剂盒检测敏感性在0.13~1.0 IU/mL;另外8种酶联免疫试剂盒和9种快速分析试剂的敏感性则为1.0~4.0 IU/mL^{[ 9]}。HBsAg诊断试剂的有效性和敏感性因不同的评价标准而有显著差异。因此,应根据我国HBV流行病学研究选择合适的诊断试剂,以确保在输血供者筛查﹑器官移植﹑乙型肝炎计划免疫等重要环节中最大程度地降低假阴性带来的严重后果。

这里,简要阐述一下HBsAg的校准物以及计量单位。HBsAg的检测从上世纪70年代开始盛行,至今已经确立了多个诊断标准品。1974年保罗-欧利希研究所(PEI)提供了2个HBsAg标准品,并首次用“ng”作为其定量单位,这2个标准品是含有50 000 PEI活性单位的天然HBsAg蛋白,分别为ad亚型和ay亚型。一个PEI 活性单位等于1 ng HBsAg,这样较强的HBV感染性限制了PEI标准品的应用。随后英国又引入了一种来源于低滴度HBV携带者血浆,经巴氏灭活方法处理后稀释使用的新标准品,其一个UK活性单位也等于1 ng HBsAg。然而问题又随之产生了,同样是1 ng HBsAg,由于定义标准不同,造成一个UK活性单位仅等于0.55 PEI活性单位。世界卫生组织(WHO)采用了UK制备的标准品作为第1代HBsAg国际标准品,此后WHO又启用了第2代HBsAg国际标准品。第2代HBsAg国际标准品同样来源于HBV携带者血浆(基因型A2,血清型adw2),但是其经过了高温与蛋白纯化处理。WHO呼吁世界各地HBsAg检测试剂盒的参照物采用国际单位(IU)制,因为许多不同组织根据不同的生化或免疫反应性指标定义的“ng”差异很大。WHO的一项研究显示,将5种不同的参照物与第2代HBsAg国际标准品相比较,结果是用“ng”来定量导致高达11倍的差异。目前,还有很多组织和产品沿用“ng”制,这给IU的换算带来了很大麻烦,不利于检测结果的互相比较。因而有必要根据我国HBV流行病学研究的成果,确立一个或几个适用于我国自身情况的HBsAg标准品,并与HBsAg 的国际标准的IU进行比较,建立统一评价标准^{[ 10~ 12]}。

HBV HBsAg血清型及其亚型不仅反应了HBsAg的构象差异,同时与HBV的感染、复制、肝损伤程度、毒力、清除和传播方式等亦有关联。HBsAg血清型的鉴定对治疗方案的选择﹑临床疾病谱、抗病毒治疗疗效、疾病转归、预后判断及疫苗预防等都具有重要的参考价值。我国大部分地区主要以adrq⁺和adw2为流行血清型,而新疆、西藏和内蒙古等地则以ayw3型为主要分布类型。有研究表明,患者在不同机会下暴露于不同亚型的HBV,有发生混合感染的可能性,并且血清中可同时呈现2种亚型的HBsAg。近年来采用HBsAg单克隆抗体取代多抗或抗血清对HBsAg的检测,发现了复合亚型adyw、adwr等HBsAg混合型的存在,从而进一步认识到HBsAg复合亚型的出现很可能与HBV的双重感染有关,当然也可能是单一HBsAg亚型病毒感染后,有HBV脱氧核糖核酸发生点突变的结果^{[ 13]}。

虽然HBV全基因或S基因序列测定、S基因聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析、HBV基因型特异性线型探针检测HBV基因型特异性引物PCR、PCR微板核酸分子杂交-ELISA和基因芯片等技术可进行HBV基因分型,但在不同HBsAg亚型的HBV多重感染的情况下,仅有HBV基因分型并不能真实反应情况,因而利用单克隆抗体检测技术鉴定HBV血清型及其亚型的免疫检测方法是目前有效和易普及的选择。由于基于该系列单克隆抗体的免疫检测方法是用不同的单克隆抗体针对不同HBsAg亚型特定的抗原表位,因此能正确反应HBV各种HBsAg亚型感染的情况。目前在我国针对HBsAg血清型及其亚型的单克隆抗体制备技术和相关的检测试剂盒尚未成熟,而国内外市场上HBsAg血清型及其亚型鉴定试剂盒也几乎还是空白。因此我们国家需要大力支持和鼓励自主研制敏感性高、特异性强的HBsAg血清型及其亚型单克隆抗体免疫检测试剂盒,从而提高对HBsAg血清型及其亚型的检测和临床应用。有机构目前正在研制敏感性高、特异性强的HBsAg血清型及其亚型免疫检测试剂盒,可以预期这一造福于全体公民的检测HBsAg血清型及其亚型试剂盒不久将会面世。

早在1992年乙型肝炎疫苗就已纳入我国儿童疫苗免疫计划,2002年实施乙型肝炎全面计划免疫。2010年2月卫生部颁布禁止入学和就业体检中检查乙型肝炎5项指标的条例,表明我国正积极利用当前基础与临床研究新进展和新成果,正确理解HBV的感染、复制和传播途径,摒弃对HBV携带者的偏见和歧视。

为显著降低我国HBV感染率,我们还需要着手于多个层次的具有创新理念的工作。在HBV预防方面,应最大程度地避免母婴垂直传播,强化HBV包括其亚型的疫苗设计与质量监控;在乙型肝炎临床诊断方面,推广HBsAg血清型及其亚型的检测,提高正确性和敏感性(早期诊断和判断预后);在疾病的治疗方面,应重视HBsAg血清型及其亚型的临床意义,利用HBV血清型及其亚型血清标志物诊断结果来指导临床医生对乙型肝炎患者进行个体化、有效和及时的治疗。在实验室诊断领域,以高特异性和高敏感性的单克隆抗体检测技术为基础,发展各种HBsAg血清型及其亚型的检测试剂盒,并符合临床实验室更好的可操作性和应用性是当前HBV感染试验诊断的发展趋势。