引用本文
李晓斐, 王丽娜. 乙型肝炎病毒YMDD变异与基因分型及临床关系的研究. 26(7): 479-481
LI Xiaofei, WANG Lina. Research of the clinical relationship between hepatitis B virus YMDD variation and genotyping. Labratory Medicine, 26(7): 479-481  
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乙型肝炎病毒YMDD变异与基因分型及临床关系的研究
李晓斐, 王丽娜
青岛市传染病医院检验科,山东 青岛 266033

作者简介：李晓斐,男,1957年生,学士,副主任技师,主要从事临床检验工作。

基金:青岛市卫生局课题(2010-wszd080);
摘要
目的

了解青岛市乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基因变异特征,探讨HBV YMDD变异与基因分型、DNA载量及临床分型的关系。

方法

应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术对820例乙肝患者血清进行基因变异检测,HBV DNA定量监测及基因分型检测。

结果

820例HBV感染者中检出YMDD变异154例,变异率18.78%;各基因型间YMDD变异的差异有统计学意义,P<0.05;患者HBeAg阳性与否与YMDD变异差异有统计学意义(P<0.05),HBeAg阳性者更易发生变异;HBV感染者临床分型各组间YMDD 变异的差异有统计学意义(P<0.05),其中以LC(36/113)、CHB(97/368)为主;病毒变异在性别、年龄及DNA载量各组间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

结论

HBV YMDD变异的监测对乙肝患者的治疗、病情预测和转归都有重要临床意义。

关键词: YMDD变异; 基因分型; 乙型肝炎病毒
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)07-0479-03
Research of the clinical relationship between hepatitis B virus YMDD variation and genotyping
LI Xiaofei, WANG Lina
Department of Clinical Laboratory, Qingdao Hospital for Infectious Diseases, Shandong Qingdao 266033, China
Fund:
Abstract
Objective

To investigate hepatitis B virus (HBV) variation features in the patients with hepatitis B in Qingdao, and the relationship of HBV YMDD variation with genotyping, DNA load and clinical classification.

Methods

The YMDD variation, DNA load and genotyping were determined in 820 patients with hepatitis B by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR).

Results

The YMDD variations were determined in 154 patients with hepatitis B, and the variation rate was 18.78%. The YMDD variations between the different genotypes were statistically different (P< 0.05). HBeAg positive or not was statistically significant with YMDD variation (P<0.05), and the variation happened more easily in the patients with HBeAg positive. YMDD variation between the different HBV infection clinical classification had statistical significance (P<0.05). The LC (36/113) and CHB (97/368) were the most. The differences between sex, age and DNA load groups were not significant (P>0.05).

Conclusions

The monitoring of HBV YMDD variation is important to the clinical therapy, prediction and prognosis.

Keyword: YMDD variation; Genotyping; Hepatitis B virus

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)为环状部分双股DNA,有3 200碱基对组成,分为长负链(L)和短正链(S),L链有4个开放读码区(S、C、P、X),其变异可发生在任何1个区域内。因为HBV在复制过程中的显著特点是经RNA进行逆转录复制,由于RNA 聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能,易发生1个或多个核苷酸错配导致变异。HBV变异可以是自然变异,也可以在免疫压力及各种抗病毒药物治疗的诱导下发生[ 1]。我国现有1.2亿乙型肝炎感染者,为了防止慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)发展为肝硬化、肝癌,目前临床主要应用抗病毒药物治疗,但抗病毒治疗时间与拉米夫定酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)变异率成正相关。变异的发生可引起乙肝病毒生物学特性的改变,例如产生耐药性,最终导致肝炎再发作。我们研究了我院近2年820例乙肝患者血清乙肝YMDD变异与HBV DNA载量、HBV基因型、HBeAg及临床分型的相关性。

材料和方法
一、标本和来源

820例HBV感染者血清均来自青岛市传染病医院2009年3月~2010年12月期间门诊和住院患者,男642例,年龄14~77岁;女178例,年龄13~71岁。其中无症状携带者(ASC)126例,急性肝炎(AH)105例,慢性乙型肝炎(CHB)368例,肝硬化(LC)113例,重型肝炎(SH)91例,原发性肝癌(PHC)17例。临床诊断均符合2000年第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准[ 2]。

二、检测试剂

HBV分型检测试剂由上海之江生物科技有限公司提供;HBV DNA定量、变异检测试剂由凯杰生物工程(深圳)有限公司提供;HBV标志物检测试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供。

三、实验方法

1. HBV变异检测 采用HBV YMDD突变型核酸检测试剂盒,按常规提取HBV DNA,然后加入HBV突变聚合酶链反应(PCR)反应液进行扩增,扩增条件为:37℃ 3min,92℃ 1min,(93℃ 2s,42℃ 20s,72℃ 20s)40个循环,37℃ 3min。经PCR扩增后,按照阳性对照可自动进行结果分析。使用仪器为罗氏LIGHTCYCLE。

2. HBV基因分型检测 采用基因分型检测试剂盒,严格按说明书操作,扩增条件为:37℃ 2min,94℃ 2min,(94℃ 10s,62℃ 40s)40个循环。经PCR扩增后,Mx3000P按照阳性对照进行结果分析。

3. HBV DNA定量检测 采用RFQ-PCR法(real time fluorogenetic quantitative PCR),操作严格按说明书,试剂盒灵敏度为103IU/mL,使用仪器为Mx3000P。

4. HBV-M检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法,操作严格按说明书。

四、统计学方法

采用SPSS17.0软件,应用卡方检验进行统计。 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、HBV变异检测结果

820例HBV感染者中YMDD变异154例,变异率18.78%,其中YIDD变异95例,占61.69%;YVDD变异51例,占33.12%;其他变异(YIDD/YVDD变异)8例,占5.19%。

二、HBV基因变异与性别和年龄的关系

男性感染者YMDD变异与女性变异间的差异无统计学意义( P<0.05)。将年龄分为4组,年龄间的差异无统计学意义( P<0.05),见 表1。

表1 HBV 基因变异与性别和年龄的相关性
三、HBV基因变异与HBV基因型的关系

HBV基因型B型27例,C型729例,BC混合型3例,主要为C型。各基因型间YMDD变异的差异有统计学意义( P<0.05),C型较B型更容易变异,见 表2。

表2 HBV 基因变异与HBV 基因型相关性
四、HBV基因变异与HBeAg的相关性

患者HBeAg阳性与否与YMDD 变异差异有统计学意义( P<0.05),HBeAg(+)者较HBeAg(-)者容易发生变异,见 表3。

表3 HBV 变异与HBeAg 相关性
五、HBV基因变异与HBV DNA载量相关性

HBV感染者HBV DNA载量与HBV 变异间差异无统计意义( P>0.05),见 表4。

表4 HBV 变异与HBV DNA 相关性
六、HBV基因变异与HBV临床分型的相关性

YMDD变异与HBV感染者临床分型各组间差异有统计学意义( P<0.05),其中以LC(36/113)、CHB(97/368) 为主,见 表5。

表5 HBV 变异与HBV 临床分型的相关性
讨 论

HBV是一个高度变异的病毒,以准种的形式存在于体内,因此在特定的环境下,适应性强的变异株被选择性扩增,代替原来占优势的野生株成为优势株;去除特定的条件后,野生株还可以重新恢复成为优势株[ 1]。然而为阻止乙肝发展为肝硬化甚至肝癌,现主要采用抗病毒治疗,抗病毒药物拉米夫定用时间越长,YMDD变异率越高[ 3],导致病毒耐药变异成为影响治疗疗效的主要障碍。本研究证明,性别、年龄和DNA载量与YMDD变异之间差异无统计学意义( P>0.05),与向田等[ 4]结果相符。但研究发现,在抗病毒过程中,慢性乙肝患者DNA载量经治疗达到较低拷贝的稳定量后,如出现病毒载量的上升,排除停药的危险性,最终导致大多数患者已发生YMDD变异,一旦发生基因变异就有产生临床耐药的危险性,最终导致肝炎复发、病情恶化,因此治疗过程中,密切监测YMDD变异已成为临床治疗的需要。

根据HBV全基因序列异质性≥8%的标准,目前将HBV分为A~H 8个基因型。HBV基因型的分布具有人种和地域性的特征,其中在我国大陆流行的基因型主要有A、B、C、D 4种[ 5]。在无症状携带者、慢性乙肝、肝硬化及肝癌的不同人群中,C基因型的检出逐渐增高,而B基因型则逐渐下降[ 6]。还有研究认为基因型C与肝硬化分别是肝癌发生的独立危险因素[ 7]。本试验显示,青岛市乙型肝炎病毒感染者HBV 基因型多为 B型和C型,以C型分布为主。YMDD变异与基因型之间差异有统计学意义( P<0.05),即C基因型在慢性乙肝治疗过程中较B基因型更易发生YMDD变异,引起病毒耐药的产生,给临床治疗增加障碍。因此,YMDD基因型与变异同时检测可为医生预测病情的发展提供依据,从而制定更具个性化的治疗方案。

临床和病毒学研究表明,在慢性HBV 感染的病程中,前C/C区变异和BCP变异与慢性肝病的发展有着紧密联系。本研究表明,YMDD变异与HBV感染者临床分型差异有统计学意义,主要分布在LC组和CHB组,阳性率分别为31.86%和26.36%;其他组阳性率均低于15%。由此说明,HBV变异的后果会显著地增强HBV复制,引起更为严重的肝细胞炎症、坏死和纤维化,加重临床结局[ 8]。

总之,HBV变异对乙肝的治疗、预后及转归都产生了很大的影响。HBV变异后可使血清学诊断为阴性,而DNA为阳性,出现临床漏检、盲目用药和延误治疗等现象。因此,HBV变异的检测,为临床诊疗提供有力依据,为医生及时采取对策或者研究新的治疗方案提供可靠依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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