引用本文
汪伟山, 张永良, 陈兴, 李桦, 周玉球, 蔡桂丰. 一株产H2S变异产肠毒素性大肠埃希菌O15:K?的鉴定与初步研究 . 26(7): 469-472
WANG Weishan, ZHANG Yongliang, CHEN Xing, LI Hua, ZHOU Yuqiu, CAI Guifeng. Preliminary investigation and identificationon the H2S-producing enterotoxigenicEscherichiacoliO15:K? . Labratory Medicine, 26(7): 469-472  
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一株产H2S变异产肠毒素性大肠埃希菌O15:K?的鉴定与初步研究
汪伟山, 张永良, 陈兴, 李桦, 周玉球, 蔡桂丰
广东省珠海市妇幼保健院检验科,广东珠海 519001

作者简介：汪伟山,男,1974年生,学士,主管技师,主要从事临床微生物检验及细菌耐药机制研究。

基金:珠海市科技计划项目(PC20071067);
摘要
目的

对新发现的1株产H2S大肠埃希菌进行细菌学鉴定,并对其生物学特性进行初步研究。

方法

对临床1例腹泻病患儿粪便标本中分离的产H2S大肠埃希菌采用形态学、培养特性、生化反应、血清学等方法进行鉴定,并用纸片扩散法进行药物敏感性试验。

结果

经全面鉴定,该菌为产H2S的产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)O15:K?,耐药性不强,对大多数抗菌药物敏感。

结论

产H2S的ETEC O15:K?是变异的致泻性大肠埃希菌,应引起临床和实验室的高度重视。致泻性大肠埃希菌产H2S变异的现象值得进一步深入研究。

关键词: 产肠毒素性大肠埃希菌; 腹泻病; H2S; 变异
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)07-0469-04
Preliminary investigation and identificationon the H2S-producing enterotoxigenicEscherichiacoliO15:K?
WANG Weishan, ZHANG Yongliang, CHEN Xing, LI Hua, ZHOU Yuqiu, CAI Guifeng
Department of Clinical Laboratory, Zhuhai Municipal Maternaland Child Healthcare Hospital, Guangdong Zhuhai 519001, China
Fund:
Abstract
Objective

To investigate preliminarily the biological characteristics of H2S-producingEscherichiacoli.

Methods

The unknown H2S-producingEscherichiacoli isolated from clinical stool specimen of a child with diarrhoea was identified for morphology,culture characteristics,biochemical reaction and serological identification. Drug resistance tests were determined by disk diffusion method.

Results

The bacterium was identified as H2S-producing enterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)O15:K? and was sensitive to most antibacterial drugs.

Conclusions

The H2S-producing ETEC O15:K? is the variant lapacticEscherichiacoli which needs further investigation. The clinic and the laboratories should pay much attention to this variation.

Keyword: EnterotoxigenicEscherichiacoli; Diarrhoea; H2S; Variation

随着生存环境的改变和抗菌药物滥用等综合因素的影响,细菌变异现象越来越普遍,从而对临床实验室诊断提出了新的挑战。产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC)能产生不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)和耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST),是引起世界上发展中国家婴幼儿和发达国家旅行者腹泻的重要病原菌。ETEC具有一般大肠埃希菌的生物学特征,罕见产生H2S。然而,由于细菌变异的存在,产H2S的大肠埃希菌也有报道[ 1, 2]。最近我们从1例腹泻患儿的粪便中分离到1株产H2S的大肠埃希菌,并对其培养特性、生化反应、抗原结构、耐药性等生物学特性进行了初步研究。

材料和方法
一、材料

1.菌株来源及临床资料 2009年10月19日从1例2月龄腹泻患儿大便标本中分离,标本号093500。患儿因腹泻4 d伴轻度脱水入院,患儿家属自诉患儿每日拉黄色稀便7~8次,量少至中,有1~2次见少许血丝,无黏液。临床医生常规送检大便培养+药敏、大便常规及轮状病毒、腺病毒检测。大便常规未见白细胞、红细胞,隐血试验阴性,轮状病毒与腺病毒检测阳性。患儿经头孢哌酮-他巴唑坦抗感染及补液等综合治疗8 d,痊愈出院。

2.仪器 法国生物梅里埃公司ATB1200细菌鉴定仪。

3.培养基 哥伦比亚血(BA)平板、麦康凯(MAC)平板、药物敏感性试验用水解酪蛋白胨琼脂(MH)平板均由广州迪景生物公司生产;海克能肠道琼脂(HE)平板、三糖铁琼脂(TSI)、亚硒酸盐增菌液(SF)均由广州微生物研究所环凯生物公司提供,SF即配即用。

4.试剂 氧化酶试剂、ID32E生化鉴定条为法国生物梅里埃公司产品。致病性大肠埃希菌(EPEC)诊断血清(15种)、ETEC诊断血清(11种)、侵袭性大肠埃希菌(EIEC)诊断血清(11种)、大肠埃希菌O157诊断血清、大肠埃希菌H7诊断血清、沙门菌诊断血清、志贺菌诊断血清均购自宁波天润公司。药敏纸片由英国Oxoid公司生产。使用珠海贝索公司生产的革兰快速染色液进行革兰染色。

二、方法

患儿粪便标本接种于BA、MAC、HE平板。另取粪便标本按 1∶10比例加入SF,置37 ℃增菌培养18~24 h后挑取培养液适量,划线接种于HE平板,37 ℃培养18~24 h后作分纯培养。挑取MAC平板上不发酵乳糖、HE平板上黑色透明或绿色透明可疑菌落进行生化鉴定、血清学鉴定及药物敏感性试验。

药物敏感性试验采用纸片扩散法。根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI) 2009年M100-S19选药规则、判读标准和质控要求进行药物敏感性试验和判定。药敏质控标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和铜绿假单胞菌(ATCC 27853)由广东省临床检验中心提供。

结 果
一、培养特性

经37 ℃培养18~24 h,MAC平板上生长不发酵乳糖,稍扁平、光滑、湿润、透明,直径约为2 mm,中等大小,边缘不整的菌落。HE平板上有黑色透明菌落生长。SF增菌后转HE平板,经37 ℃培养18~24 h大量黑色透明菌落生长。BA平板上为光滑、湿润、稍凸起、圆形、不透明、无溶血、直径约2~3 mm、边缘不整的灰白色菌落。在TSI分解葡萄糖产酸产气,不分解乳糖,产生大量H2S,但经数次传代培养后部分菌株可失去产H2S能力。接种于半固体琼脂可见动力阳性。在营养肉汤中呈均匀、混浊生长,并形成一层薄薄的菌膜,混匀时可见管底有颗粒状沉淀浮起。

二、生化特性

革兰阴性小杆菌,两端钝圆,无芽胞,氧化酶阴性。经ID32E生化鉴定条在ATB1200上鉴定为大肠埃希菌(id%=99.9,T=1.00),生化谱为54465543400,见 表1。

表1 产H2S大肠埃希菌生化鉴定结果
三、抗原特性

致泻性肠道大肠埃希菌主要是由菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和荚膜(K)抗原3部分组成。O抗原为菌细胞壁上的糖、脂类和蛋白质复合物,H抗原含有蛋白质,K抗原位于菌细胞壁外层。初次分离者,大部分具有K抗原,其能抵抗吞噬细胞的吞噬作用,故毒力较强。本次分离的产H2S 大肠埃希菌与沙门菌A-F多价血清、Vi因子血清、志贺菌多价血清均不凝集,在生理盐水中无自凝现象。与ETEC多价2血清及O15:K?血清强凝集,而与其他大肠埃希菌多价血清、单价血清均无凝集。依文献[3]取纯培养物制成3麦氏单位菌液,与40倍稀释的O15:K?血清等体积混匀进行试管凝集试验,50 ℃水浴16 h后出现凝集现象。纯培养物制成浓菌液煮沸30 min灭活后与O15:K?血清做玻片凝集试验,呈强阳性反应。因此,确定该菌为产H2S的ETEC O15:K?。

四、耐药性

该株ETEC O15:K?不产生超广谱β-内酰胺酶,对大多数抗菌药物敏感,对复方磺胺甲口恶唑、米诺环素耐药。见 表2。

表2 ETEC O15:K?的药物敏感性试验结果
讨 论

致泻性大肠埃希菌是细菌性腹泻的常见病原菌,包括EPEC、ETEC、EIEC、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)和肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)以及近来发现的肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希菌(ESIEC)。致泻性大肠埃希菌引发的肠道感染疾病越来越多,在肠道病原菌中所占比例已超过志贺菌成为最常见的腹泻病原菌,而<5岁儿童是最易感染的人群[ 4]。因此,我们在腹泻病的病原学诊断工作中应重视致泻性大肠埃希菌的检测。大肠埃希菌在麦康凯平板上可形成2种不同的菌落,最常见的是不透明、粉红色菌落,而部分不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株则呈无色透明菌落。我们在临床实践中发现,致泻性大肠埃希菌多为不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株,经生化反应鉴定为大肠埃希菌后应进行血清学试验,并结合临床症状以明确是否为致泻性大肠埃希菌。

ETEC是主要的致泻性大肠埃希菌之一。一般认为,ETEC属于非侵袭性细菌,其进入宿主体内后,由定居因子(CFAs)黏附于小肠上皮细胞并分泌LT和/或ST。LT或ST均可影响宿主肠道细胞对电解质、水的吸收和分泌功能,造成分泌性腹泻[ 5]。因此,ETEC的致病性较强,可引起重症腹泻。据报道每年全球由此菌引起的腹泻达6亿例次,病死数超过120万例,其中<5岁的儿童死亡数为70万例[ 6]。

金以森[ 7]认为ETEC合并其他腹泻病原体感染比较常见,这也是出现大便性状和临床症状多样化的原因。俞守义等[ 8]报道,51.81% ETEC合并感染其他病原体,<2岁的幼儿一半以上合并轮状病毒感染。本例患儿同时合并轮状病毒和腺病毒感染,提示我们对腹泻患者尤其是婴幼儿腹泻的诊疗不能仅满足于一种病原体的检出,而忽视混合感染。大便细菌培养应是腹泻患者必不可少的常规检验项目之一。

不产H2S是鉴别大肠埃希菌的重要生化特性,TSI底层不产酸(GLU阴性),或即使GLU阳性而H2S、氰化钾(KCN)、尿素有任一项为阳性者,均可排除大肠埃希菌[ 3]。本研究报道产H2S变异的ETEC,对临床细菌学检验是一个有益的提示,临床实践中不仅要注意典型特征的致病菌,同时要关注细菌的变异现象。微生物检验不能教条照搬书本,对于不典型的细菌要以科学的态度认真对待,不断提高检测能力,拓展微生物学研究的领域。使用有指示作用的选择性培养基,不但有利于目标致病菌的检出,而且有利于变异菌株的发现,如该株产H2S 变异ETEC的发现就得益于为筛选沙门菌而使用的HE平板。

萧树生等[ 9]曾报道10例ETEC产LT/ST的症状都较轻,本例患儿临床症状类似,是否与其所产生的肠毒素类型有关以及产H2S变异对其毒力是否有影响等均需作进一步研究。该株产H2S的ETEC O15:K?通过数次传代培养后,部分菌株可失去产H2S的能力,说明其变异并不稳定。大肠埃希菌产H2S的原因与机制值得进一步深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 丁业荣, 杨杰, 范玉珍, 等. 产H2S肠道致病性大肠埃希菌O128: K67的发现与研究[J]. 安徽卫生职业技术学院学报, 2003, 2(5): 85-88. [本文引用:1]
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[3] 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会. 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检验[S]. GB/T4798. 6－2003, 2003. [本文引用:1]
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[7] 金以森. 肠产毒素大肠杆菌感染性腹泻研究进展[J]. 浙江预防医学, 2005, 17(10): 58-59. [本文引用:1]
[8] 俞守义, 陈义忠, 陈清, 等. 产肠毒素大肠杆菌腹泻病的系列研究(Ⅱ)临床特点[J]. 第一军医大学学报, 1994, 14(2): 133-135. [本文引用:1]
[9] 萧树生, 林柳英. 病原性大肠埃希菌腹泻的实验与临床研究[J]. 现代预防医学, 2005, 32(9): 1101-1102. [本文引用:1]