引用本文
宋斌斌, 赵瀛, 张春燕, 吴炯, 郭玮, 潘柏申. 两种抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的结果比较. 26(7): 457-460
SONG Binbin, ZHAO Ying, ZHANG Chunyan, WU Jiong, GUO Wei, PAN Baishen. The result comparison between two ANCA detection methods. Labratory Medicine, 26(7): 457-460  
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两种抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的结果比较
宋斌斌, 赵瀛, 张春燕, 吴炯, 郭玮, 潘柏申
复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032

通讯作者：郭玮,联系电话：021-64041990-2376。

作者简介：宋斌斌,男,1976年生,学士,主管技师,主要从事临床免疫检验工作。

摘要
目的

比较间接免疫荧光法(IIF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)结果的一致性。

方法

回顾1 337例同时使用IIF和ELISA检测ANCA的结果,比较2种方法结果的一致性并进行原因分析。

结果

2种方法联合检测出90例ANCA阳性结果,阳性一致性为83.82%,阴性一致性为98.27%,结果一致性较好(Kappa值>0.75)。22例IIF阴性、ELISA阳性的样本中有14例抗核抗体阳性。11例ELISA阴性,IIF阳性的样本中有1例杀菌/通透性增强蛋白(BPI)阳性。

结论

IIF和ELISA单独检测均有漏检,联合检测的效果最佳。

关键词: 抗中性粒细胞胞浆抗体; 蛋白酶3; 髓过氧化物酶; 间接免疫荧光法; 酶联免疫吸附试验
中图分类号:R 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)07-0457-04
The result comparison between two ANCA detection methods
SONG Binbin, ZHAO Ying, ZHANG Chunyan, WU Jiong, GUO Wei, PAN Baishen
Department of Clinical Laboratory, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
Abstract
Objective

To compare the consistency between the results of the antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) detection by the indirect immunofluorescence (IIF) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Methods

The results of ANCA analysis by IIF and ELISA were reviewed in 1 337 cases. The consistency between the results by the 2 different methods was compared, and the cause factor was analyzed.

Results

90 cases were positive by the 2 methods together. The positive consistency rate was 83.82%, and the negative consistency rate was 98.27%. The consistency was well (Kappa>0.75). 22 samples were negative by IIF and positive by ELISA. Among them, 14 samples were recognized anti-nuclear antibody positive. In 11 samples which were negative by ELISA positive by IIF, there was 1 recognized positive of bacterial/permeability increasing protein (BPI).

Conclusions

Detecting ANCA only by IIF or ELISA can bring some parts of false-negative results, while the combination with 2 methods could gain the best results.

Keyword: Antineutrophil cytoplasmic antibody; Proteinase 3; Myeloperoxidase; Indirect immunofluorescence; Enzyme-linked immunosorbent assay

抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)是一类针对中性粒细胞颗粒和单核细胞溶酶体的IgG抗体。近20多年来,众多文献证明小血管炎包括韦格纳氏肉芽肿、显微多血管炎、Churg-Strauss综合征以及肾肺综合征的发病均与ANCA有着密切的关系。与之相关的多种靶抗原也相继被报道,其中临床意义最为突出的是蛋白酶3(PR3)和髓过氧化物酶(MPO)[ 1~ 3]。通过ANCA的实验室检测结果可以帮助临床诊断此类疾病,并且ANCA的浓度与疾病的进程、复发以及疗效均有关系[ 4~ 6]。目前,ANCA实验室检测技术包括间接免疫荧光法(IIF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫法(RIA)、免疫印迹法(IB)以及流式细胞术(FCM)等[ 7~ 9],但临床应用最广泛的主要为IIF和ELISA。我们同时使用IIF和ELISA检测ANCA,并对2种方法的结果一致性进行分析。

材料和方法
一、材料

1.研究对象 回顾2010年1月至4月复旦大学附属中山医院检验科的ANCA检测结果1 337例,所有阳性结果的血清分管并置-70 ℃保存。

2.仪器和试剂 (1)IIF试剂:德国欧蒙公司的粒细胞马赛克检测试剂盒(批号F100301YK),该试剂每份检测区包含4种生物薄片,分别为乙醇固定的粒细胞、甲醛固定的粒细胞、HEp-2细胞和灵长类肝组织;(2)荧光显微镜:德国欧蒙公司的Eurostar荧光显微镜;(3)PR3、MPO试剂:德国欧蒙公司的MPO、PR3 ELISA试剂盒(批号分别为E091015BK、E091027AQ);(4)ANCA其他靶抗原(包括乳铁蛋白、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和细菌杀菌/通透性增强蛋白)确认试剂:德国欧蒙公司的抗粒细胞胞浆抗体谱IgG检测试剂盒(ELISA,批号E090911AD);(5)酶标仪:上海科华公司的ST-360全自动酶标仪。

二、方法

1.IIF检测ANCA 操作过程严格按照厂商试剂说明进行,每次实验同时检测阴、阳性对照血清。血清稀释比为1∶10,荧光抗体采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG抗体,400倍荧光显微镜下乙醇固定的中性粒细胞基质片呈现均匀的胞浆颗粒状特异性荧光的判断为胞浆型(cANCA)阳性;呈现核周条带状特异性荧光的判断为核周型ANCA(pANCA)阳性。由于抗核抗体ANCA(ANA)会对乙醇固定的中性粒细胞基质片ANCA的判断造成干扰,因此如果Hep2细胞基质片呈阳性且甲醛固定的中性粒细胞基质片不呈现特异性荧光的均判断为ANA干扰,ANCA判断为阴性。所有阳性荧光模型的判定均由2位读片经验丰富的中级技术人员一同判定。

2. ELISA定量检测PR3和MPO 操作过程严格按照试剂说明书进行,阳性判定Cut-off值为≥20 RU/mL。

3. 非PR3、MPO的其他ANCA靶抗原检测 所有IIF检测结果阳性,PR3、MPO ELISA检测结果阴性的血清进行ANCA其他靶抗原的ELISA检测,操作严格按照试剂说明书进行。样本吸光度与标准品吸光度×0.2的比值≥1判断为阳性。

三、统计学方法

采用SPSS 11.0 统计学软件对2种方法的阳性率进行χ2检验;结果一致性进行 Kappa检验。

结 果

一、IIF和ELISA同时检测1 337例ANCA血清样本的结果比较见 表1。2种方法联合检测出90例阳性,阳性率为6.73%。IIF单独检测出68例阳性,阳性率为5.09%。ELISA单独检测出79例阳性,阳性率为5.91%,略高于IIF( χ2 =4 .49, P=0.034)。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI) EP12-2A 文件公布的2种定性检测方法的一致性比较要求,2种方法的阳性结果一致性为83.82%(95%可信区间:73.73%~90.30%);阴性结果一致性为98.27%(95%可信区间:97.39%~98.85%);总体样本结果的一致性为97.53%(95%可信区间:96.21%~98.58%)。根据 Kappa一致性检验, Kappa值为0.763,表明2种方法的一致性较好。

表1 IIF与ELISA检测ANCA的结果比较

二、22例IIF结果为阴性、ELISA结果为阳性的样本中有16例为PR3阳性,定量结果为(34.3±15.9) RU/mL,其中伴有10例ANA为阳性;6例MPO阳性,定量结果为(21.2±1.5) RU/mL,其中伴有4例ANA为阳性。

三、11例IIF检测结果为阳性、PR3和MPO检测结果为阴性的血清样本进行其他ANCA相关靶抗原ELISA检测的结果见 表2。检出1例细菌杀菌/通透性增强蛋白阳性。

表2 其他ANCA相关靶抗原检测结果
讨 论

ANCA对于小血管炎的致病、诊断、病程监测及复发预示的临床价值已经得到证实[ 4~ 6],国际ANCA检测和报告工作组于1999年制订了实验室检测ANCA的推荐导则[ 10],导则建议以IIF作为初筛实验,特异性靶抗原(PR3和MPO)作为确认实验。但由于实验条件或经济因素的限制,单独使用IIF或ELISA进行ANCA检测的方式均比较普遍。随着生物基质片制造工艺的标准化和商业化以及ANCA重组混合抗原和锚式联接技术的应用,使得2种方法的检测性和结果一致性均得到明显改善[ 11, 12]。因此有学者提出以ELISA为初筛,IIF作确认的修正建议[ 13]。

本研究采用IIF和ELISA同时检测了1 337例ANCA血清样本,有90例结果呈阳性,阳性率为6.73%,比Xin等[ 14]研究的中国人群的ANCA阳性率略高。2种方法的结果一致性较好( Kappa值为0.763),但阴性结果一致性达到98.27%,而阳性结果一致性只有83.82%。ELISA的阳性检出率高于IIF( P<0.05)。分析原因,我们首先发现22例IIF阴性、ELISA阳性的样本其PR3、MPO的浓度均较低。此类低浓度样本导致IIF表现为极弱的荧光或阴性,直接造成了IIF的漏检。Russel等[ 15]和Vermeersch等[ 16]的研究也得到了类似的结果。其次这22例样本中有14例ANA的检测结果为阳性。ANA与ANCA同时存在的现象十分普遍,而ANA对IIF检测ANCA的干扰多有报道[ 17, 18],虽然本研究使用了乙醇和甲醛固定的粒细胞、HEp-2细胞和灵长类肝组织4种生物基质片同时对1份血清进行IIF检测,能够较有效的去除ANA的干扰,但并不能完全排除。因此部份ANCA和ANA同时阳性的样本可能会由于无法鉴别而被判定为阴性,此时选用特异性的ELISA检测则不会造成漏检。

研究发现ANCA与炎症性肠病、肾小球基底膜疾病、Felty综合征以及慢性呼吸道感染等疾病也均有关系[ 7, 8]。此类疾病ANCA的荧光表现也以pANCA为主。虽然有学者认为此类pANCA的表现有异于典型的pANCA[ 18],但在实际工作中很难进行明确的鉴别,因此我们的研究仍将其归为pANCA。与此类疾病相关的ANCA靶抗原却以非MPO为主,粒细胞特异性弹性蛋白酶、乳铁蛋白、组织蛋白酶G、细菌杀菌/通透性增强蛋白、人溶菌酶相光膜蛋白2等靶抗原均有报道[ 19]。本研究结果仅发现了1例细菌杀菌/通透性增强蛋白阳性的病例,其余10例IIF单独阳性的病例均未能检测到特异性的靶抗原。分析原因,我们认为IIF采用粒细胞固定的生物基质片,几乎能够检测出血清中所有针对ANCA相关靶抗原的抗体。而ELISA只能检测单一的抗原成份,并且依赖于商业化试剂的开发,并非所有的ANCA靶抗原均能常规检测。因此IIF检测能够提供临床更丰富的信息,临床可以根据个体的临床表现或诊疗需要进一步进行多样化的ANCA相关靶抗原的检测。

总之,本研究发现虽然2种方法的一致性检验结果较好,但IIF的结果判断需要经验丰富的技术人员,且无法完全排除ANA的干扰;ELISA的敏感性较优,但仅能反映PR3和MPO 2种靶抗原的情况,因此对于临床高度怀疑ANCA相关疾病的患者建议联合2种方法共同检测。

The authors have declared that no competing interests exist.

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