两种倍量稀释法批量检测孕妇IgG抗A(B)效价的比较分析
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倪建萍, 卢文波. 两种倍量稀释法批量检测孕妇IgG抗A(B)效价的比较分析. 2011, 26(6): 415-418
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两种倍量稀释法批量检测孕妇IgG抗A(B)效价的比较分析
作者简介：倪建萍,女,1968年生,学士,副主任技师,主要从事输血及血型、血清学检测工作。
摘要
目的
探讨微量板倍量稀释法在实验室大批量检测O型孕妇IgG抗A(B)效价的可行性。
方法孕妇血清用2巯基乙醇(2-Me)处理后,用试管和微量板平行倍量稀释,再用微柱凝胶抗人球蛋白卡平行检测IgG抗A(B)效价,以2+为判定终点。全部样本由同一操作者重新用上述试剂再操作1次,以观察重复性。
结果试管倍量稀释法与微量板倍量稀释法平行检测O型孕妇血清IgG抗A(B)效价,其中抗体效价<1∶256者,试管倍量稀释法为44.21%,微量板倍量稀释法为46.81%;抗体效价≥1∶256者,试管倍量稀释法和微量板倍量稀释法各占55.32%和53.19%,两者结果差异无统计学意义(
微量板倍量稀释法检测O型孕妇IgG抗A(B)效价与试管倍量稀释法结果相符,其不仅缩短了试验时间,减轻操作者劳动强度,而且重复性好,易于标准化,更适宜于实验室大批量样本检测。
关键词:
微量板倍量稀释法; 试管倍量稀释法; 重复性; 新生儿溶血病
中图分类号:R446.61
文献标志码:A
文章编号:1673-8640(2011)06-0415-04
Keyword:
新生儿溶血病(haemolytic disease of newborn,HDN)是一种常见于胎儿和早期新生儿的、与溶血相关的自限性免疫综合征。由母婴血型不合引起,主要发生于ABO血型系统。大量研究显示,ABO HDN的发病与其母亲体内的IgG抗A(B)效价高低呈正相关[ 1, 2]。目前,微柱凝胶法检测O型孕妇血清中IgG抗A(B)效价敏感性高,结果准确可靠。但传统的试管倍量稀释法在目前大批量的常规检测中操作繁琐、耗时长,而且存在不易标准化的缺点,为此我们用传统试管倍量稀释法和微量板倍量稀释法平行检测O型孕妇血清中IgG抗A(B)效价,并做重复性试验,以评价微量板倍量稀释法在大批量孕妇IgG抗A(B)效价检测中的应用价值。
材料和方法
一、样本来源
2008年12月10至15日随机来宁波市妇女儿童医院检测的O型孕妇(配偶非O型)94名,年龄20~38岁,孕16~40周,其中配偶A型40名,B型33名,AB型21名。94名孕妇中包括高效价复查者。样本号:配偶A型1~40号;配偶B型41~73号;配偶AB型74~94号。
二、试剂和仪器
0.2 mol/L 2巯基乙醇(2-Me)应用液和2%A、B、AB标准红细胞生理盐水悬液自制。大龙单道可调移液器、大龙电子8道可调移液器由大龙医疗设备(上海)有限公司生产。LISS/Coombs试剂卡、37 ℃恒温孵育箱、卡式离心机由瑞士达亚美公司提供。96孔酶标板。MM-1型微量振荡器由姜堰市沈高康健生化器具厂生产。
三、方法
采用微柱凝胶法[ 3]。
1. 试管倍量稀释法 将受检者血清200 μL加2-Me 200 μL混匀,置37 ℃水浴2 h,取出置2~6 ℃冰箱过夜。取若干个试管架,样本排列见 表1,每一样本取玻璃小试管11支,从第1管起加生理盐水100 μL,加至第11管。接着,第1列的1~5管各加已处理的受检者血清100 μL,混匀。从第1个样本起,从第1管吸取100 μL稀释血清至第2管,依次类推,倍量稀释至第11管,最后100 μL弃去。其效价依次为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096。第2、3、4、5……94个样本按上述依次稀释。接着在每个样本的第6至第11稀释管加入与配偶ABO血型相同的2%新鲜标准红细胞生理盐水悬液100 μL,振荡混匀后置37 ℃恒温孵育箱孵育15 min。然后将每行的第11至第6稀释管中的样本各50 μL从后至前依次移至已标记的LISS/Coombs卡检测孔中。立即置卡式离心机离心10 min,观察结果。以2+凝集为判定终点。
 | 表1 试管倍量稀释法的样本排列 |
2. 微量板倍量稀释法 将受检者200 μL血清加2-Me 200 μL混匀,置37 ℃水浴2 h,取出置2~6 ℃冰箱过夜。取若干块96孔酶标板,样本排列见 表2,用大龙电子8道可调移液器从第1列1~8孔起加生理盐水100 μL,加至第11列。接着,第1列1~8孔各加已处理的受检者血清100 μL。然后从第1列起,用大龙电子8道可调移液器混匀吸取100 μL稀释血清至第2列,依次类推,倍量稀释至第11列,最后100 μL弃去。其效价依次为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096。第9~16、17~24、……94个样本按上述依次稀释。接着用大龙电子8道可调移液器从第6列~11列的1~8行稀释孔加入与配偶ABO血型相同的2%新鲜标准红细胞生理盐水悬液100 μL。微量振荡器混匀5 min后,置入37 ℃恒温孵育箱孵育15 min。然后将每行的第11至第6稀释孔的样本各50 μL从后至前依次移至已标记的LISS/Coombs卡检测孔中。立即置卡式离心机离心10 min,观察结果。以2+凝集为判定终点。
| 表2 微量板倍量稀释法的样本排列 |
3. 重复性试验 全部样本由同一操作者重新用上述试剂、仪器再检测1次,以观察重复性。
四、统计学方法
采用χ2检验进行统计分析, P<0.05为差异具有统计学意义。
结 果
一、2种稀释法检测IgG抗A(B)效价对比
2种稀释方法平行检测94份孕妇IgG抗A(B)效价,其中抗体效价<1∶256者,试管倍量稀释法为44.21%(42例),微量板倍量稀释法为46.81%(44例);抗体效价≥1∶256者,试管倍量稀释法为55.32%(52例),微量板倍量稀释法为53.19%(50例),2种稀释方法检测孕妇IgG抗A(B)效价差异无统计学意义( χ2=0.085, P>0.05),见 表3。
| 表3 2种倍量稀释法检测IgG抗A(B)效价对比(例) |
二、2种稀释法重复性比较
94份样本平行重复性试验,其效价一致率,试管倍量稀释法为90.4%,微量板倍量稀释法为97.8 %,2种倍量稀释法检测孕妇IgG抗A(B)效价重复性差异有统计学意义( χ2=4.76, P<0.05),微量板倍量稀释法的重复性明显高于试管倍量稀释法,见 表4。
| 表4 2种倍量稀释法检测IgG抗A(B)效价的重复性对比(例) |
讨 论
HDN是一种与遗传有关的同种免疫性疾病,临床上以ABO血型不合最为常见,主要表现为孕妇为O型,胎儿为A或B型。其发病机制为胎儿从父亲遗传而获得的A或B血型抗原恰为母亲所缺少,妊娠或分娩时胎儿红细胞上的此种抗原进入母亲的血液循环,刺激其产生IgG抗A(B),此种抗体可通过胎盘转移到胎儿血液循环,与胎儿红细胞表面的A或B抗原特异结合,激活胎儿免疫系统,使胎儿或新生儿红细胞破坏溶解,严重的可引起早产、流产、死胎或造成新生儿溶血性贫血、水肿,并可能发展成核黄胆,造成智能低下的后遗症或新生儿死亡。但因O型血个体血清中的抗A和抗B也可由自然环境中类似A、B抗原物质的免疫刺激产生,并于妊娠后通过胎盘进入胎儿体内引起溶血,故ABO HDN也可能发生在第1胎[ 4]。目前公认的观点是夫妇血型不合的孕产妇血清中IgG血型抗体效价与HDN的发生率呈正相关,且HDN的发生率随母体IgG抗A(B)水平的升高而升高。故若产前检测出夫妇ABO血型不合,孕期应定期对孕妇进行IgG抗A(B)效价检测,这对预防和早期诊断、治疗ABO HDN有积极意义。当孕妇IgG抗A(B)效价≥1∶64可认为有临床意义,当效价≥1∶256或检测到抗体效价持续升高4倍以上时,可认为胎儿受害的可能性大,应进行定期检测,必要时采取药物治疗[ 3]。
应用科学有效的方法检测孕妇血清中的IgG抗A(B)效价是预防HDN的重要措施。目前微柱凝胶法检测孕妇IgG抗A(B)效价操作简便,敏感性高,结果准确、可靠、易于判断。但传统的试管倍量稀释法在大批量样本检测中操作繁琐、耗时长,不易标准化。与试管倍量稀释法相比,微量板倍量稀释法检测结果与试管倍量稀释法相符,且微量板倍量稀释法缩短了试验时间,减轻操作者劳动强度,重复性更好,易于标准化,更适宜于实验室大批量样本检测。有条件的实验室还可在全自动稀释仪上操作,则更具自动化、标准化的优点。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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