引用本文
吴蓉, 张隆, 华玲, 戴俊华, 刘丽丽, 康向东. 尿液中大肠埃希菌实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立. 2011, 26(6): 368-371
WU Rong, ZHANG Long, HUA Ling, DAI Junhua, LIU Lili, KANG Xiangdong. Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitationpolymerasechainreactionfordetectionofEscherichiacoliinurine . Labratory Medicine, 2011, 26(6): 368-371  
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尿液中大肠埃希菌实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立
吴蓉1, 张隆1, 华玲2, 戴俊华1, 刘丽丽1, 康向东1
1.上海中医药大学附属普陀医院检验科,上海 200062
2.上海市浦东新区公利医院检验科,上海 200135

作者简介：吴蓉,女,1970年生,学士,副主任技师,主要从事细菌耐药机制研究。

通讯作者：康向东,联系电话：021-62160801。

摘要
目的

建立实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测大肠埃希菌的方法,检测泌尿道感染患者尿液样本,评估应用RQ-PCR法在检测大肠埃希菌尿路感染的意义。

方法

选择大肠埃希菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测靶基因设计引物,建立SYBR GREEN I RQ-PCR检测体系。

结果

引物特异性好,标准曲线相关系数在0.990 ~0.996 之间。熔解曲线显示产物特异性较强,无非目的条带和二聚体产生。在最低检测限(102拷贝/μL)以上,能对大肠埃希菌样本进行检测,且重复性好。

结论

RQ-PCR是一种快速、敏感、特异、重复性好的定量检测大肠埃希菌质粒DNA方法,可用于定量检测临床患者尿液样本中大肠埃希菌含量。

关键词: 大肠埃希菌; DNA; 质粒; 尿液; 实时定量聚合酶链反应
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)06-0368-04
Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitationpolymerasechainreactionfordetectionofEscherichiacoliinurine
WU Rong1, ZHANG Long1, HUA Ling2, DAI Junhua1, LIU Lili1, KANG Xiangdong1
1.DepartmentofClinicalLaboratory,PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai 200062,China
2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiPudongGongliHospital,Shanghai 200135,China
Abstract
Objective

To establish a method for detectingEscherichiacoli in urine of patients with urinary tract infection by real-time fluorescent quantitation polymerase chain reaction (RQ-PCR) and evaluate the significance of this method.

Methods

Escherichiacoli β-D-galactosidase gene was used to design primers for RQ-PCR. SYBR GREEN I was used in RQ-PCR.

Results

The specificity of primer was good, and the correlation coefficient of standard curve was 0.990-0.996. Melt-curve analysis showed that the primers were specific, and no nonspecific products such as nonspecific bands and primer-dimers were produced.Escherichiacoli could be detected when the minimum detection limit ofEscherichiacoli was above 102 copies/μL. The repeatability was good.

Conclusions

RQ- PCR is a fast, sensitive and specific method with good repeatability to examineEscherichiacoli plasmid DNA, which can be used to detectEscherichiacoli level in the urine of the patients with urinary infection.

Keyword: Escherichiacoli; DNA; Plasmid; Urine; Real-time quantitation polymerase chain reaction

泌尿道感染是临床较为常见的一种细菌感染性疾病,泌尿道感染病原菌以革兰阴性杆菌为主,有报道超过70%,其中大肠埃希菌又占绝对优势[ 1~ 3]。临床诊断主要采用中段尿培养,细菌鉴定一般要2~3 d的时间。本研究建立了实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测大肠埃希菌的方法,探索尿样本大肠埃希菌快速、准确、定量的诊断方法,为泌尿道感染的早期诊断提供新的有效的方法,为临床泌尿道大肠埃希菌感染的早期治疗提供实验室依据。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 收集上海中医药大学附属普陀医院细菌室自2010年8月至2010年12月临床送检的尿液样本15 例(包括6株大肠埃希菌、 2株肺炎克雷伯菌、2株粪肠球菌、1株铜绿假单胞、1株阴沟肠杆菌和3株阴性样本),全部菌株均使用法国生物梅里埃公司ATB Expression细菌鉴定仪鉴定菌种。标准菌株大肠埃希菌ATCC 25922由上海市临床检验中心提供。

2. 试剂 SYBR GreenⅠ PCR 荧光染料、Taq DNA 聚合酶试剂盒购自TAKARA有限公司,dNTP购自上海中晶生物有限公司,普通质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自上海天根生化公司,T4连接酶购自上海皓嘉生物公司,引物序列根据美国GenBank数据库,使用Primer5软件设计,由上海生工生物工程有限公司合成。

二、方法

1. 提取细菌质粒DNA 标准菌株质粒DNA提取:取大肠埃希菌(ATCC25922)菌悬液1 mL,煮沸10 min,13 000 r/min(离心半径10 cm)离心2 min。上清液即为基因检测的模板液。

临床尿样本细菌质粒DNA提取:吸取混匀的临床中段尿样本1 mL置入1.5 mL离心管内,4 000 r/min(离心半径10 cm)离心5 min,弃上清,加入200 μL水,煮沸10 min,13 000 r/min(离心半径10 cm)离心2 min。取上清液即为基因检测的模板液,-20 ℃冰箱保存备用。

2. 引物特异性验证 利用大肠埃希菌β-右旋半乳糖苷酶基因(β-D-galacto-sidase gene)的保守性,选用该基因作为RQ-PCR检测靶基因,设计引物。引物序列:上游:5'-GCTTCGTCT-GGGACTTGGT-3';下游:5'-GGTATTCGCTGGTCA-CTTCG-3',目的片段234 bp。

用常规PCR 验证所设计引物的特异性,模板为大肠埃希菌(ATCC25922 )和本院患者尿液中分离菌株的DNA,PCR扩增热循环参数为: 95 ℃预变性3 min,然后95 ℃30 s→59 ℃30 s→72 ℃30 s,循环30次,72 ℃延伸10 min,产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,出现与阳性对照分子大小相当的目的条带为阳性,从而判断所设计引物的特异性。

3. 标准品质粒的构建 以大肠埃希菌(ATCC25922)DNA作为模板,并以所设计引物进行常规PCR 反应,PCR 产物为234bp,扩增片段经回收、纯化后用T4连接酶连接,构建重组质粒,并转化入大肠埃希菌DH5α中筛选重组子。重组表达质粒经PCR验证,确定构建质粒的准确性。增菌培养,提取重组克隆质粒,纯化后,将质粒提取物以去离子水稀释,于eppendorf Biophotometer紫外分光光度计上进行定量,测定其在260 nm与280 nm的吸光度( A值),判断其纯度( A值260/280>1.8 为纯品),根据pUC18/19DNA在溶液中的浓度,计算出所提取质粒DNA 拷贝/μL,-70 ℃保存。

4. 荧光定量PCR 扩增反应体系 20 μL反应体系:SYBR GreenⅠ混合液10 μL,上下游引物各0.4 μL,ROX0.4 μL,DNA 模板1 μL及H2O 7.8 μL。反应程序为:95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 个循环。在每一循环的退火阶段收集荧光进行实时检测。反应结束后先加热到95 ℃,然后降至60 ℃开始缓慢升温(0.2 ℃/s)至95 ℃,记录荧光信号的变化,得出扩增产物的熔解曲线。设肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、铜绿假单胞、阴沟肠杆菌等检验特异性,设去离子水为阴性对照。

5. 敏感性检测 将标准品质粒进行10 倍梯度稀释,取103、102、101、100、10-1 5个级别,同时设立灭菌去离子水阴性对照,不同反应板多次重复实验。

6. 线性标准曲线建立 将标准品质粒进行10 倍梯度稀释至102拷贝/μL质粒DNA,根据对敏感性检测结果建立102 ~108 7个浓度的标准曲线,取1 μL用作荧光定量PCR 参比模板。在PCR反应过程中由实时荧光定量PCR 仪自动绘制线性标准曲线。

7. 荧光RQ-PCR对临床尿液样本大肠埃希菌的检测 对15例泌尿道感染患者的中段尿样本进行RQ-PCR 检测,反应体系同前,模板均1 μL,反应结束后调节基线至适宜处,各荧光曲线与基线交叉点对应的横坐标即为Ct值,根据标准曲线上的浓度与Ct值对应关系,推算出各待测临床样本初始大肠埃希菌含量。

结 果
一、引物特异性验证

定性PCR 扩增基因结果表明,只有大肠埃希菌(ATCC25922)及含大肠埃希菌临床尿样本在234bp 处有目的条带产生,且条带单一,其余菌株和水中均无扩增。证明设计的引物符合PCR 检测反应特异性的要求,见 图1。

图1 定性PCR 扩增基因电泳图

所有浓度下均可检测到明显的峰值,且无非特异性扩增的杂峰及引物二聚体的低矮小峰出现,再次佐证了产物的特异性,见 图2。

图2 熔解曲线分析

二、标准曲线线性范围

紫外分光光度计鉴定DNA 质量结果 A值260/280>1.8,证明DNA 模板纯度达到要求。含有大肠埃希菌β-右旋半乳糖苷酶基因的重组质粒DNA浓度在102~108 /μL时,建立标准曲线,重复5 次标准曲线理想,重复性好,线性关系很好,R2都在0.990~0.996之间。

三、敏感性检测

从103/μL 到去离子水阴性对照(NTC),所有反应孔中均检测到荧光信号,102/μL与NTC的Ct值范围没有重叠,而101 /μL、100 /μL、10-1 /μL和NTC的 Ct值之间均有交叉重叠,见 表1。

表1 敏感性测定
四、方法的重复性

对107、105、103 3种不同浓度的质粒重复检测3次,3种浓度质粒检测结果的Ct值变异系数( CV)分别为0.50%、1.89 %和2.14 %,均在合理范围内。结果显示,本实验建立的大肠埃希菌RQ-PCR检测方法具有较好的稳定性。

五、样本检测结果

对15 例经细菌培养鉴定的临床尿液样本(包括6株大肠埃希菌、 2株肺炎克雷伯菌、2株粪肠球菌、1株铜绿假单胞、1株阴沟肠杆菌和3株阴性样本)进行RQ-PCR 检测,培养鉴定结果为大肠埃希菌的样本,检测的Ct值均在13~23之间,而非大肠埃希菌的细菌及培养未检出细菌的样本Ct值均在29和34之间,部分结果显示,见 图3。

图3 临床样本扩增荧光曲线

讨 论

大肠埃希菌的检测方法主要依靠细菌分离、培养和鉴定,但这种方法存在耗时长、成本高及敏感性低等问题。随着分子遗传学和分子生物学的发展,尤其是RQ-PCR为细菌的诊断提供了新的方法。RQ-PCR 技术[ 4]具有快速、准确、特异性高、重复性好等特点,已广泛用于基因表达和病原体检测等诸多领域。该技术能有效解决传统PCR的污染问题且操作简便,特异性强;更重要的是不受样本中存在抗菌药物或其他抑菌物质的干扰,因而得到了广泛的关注。RQ-PCR 方法分非特异性荧光标记(如SYBR Green法)和特异性荧光标记(如TaqMan探针法)两种,探针法特异性强,染料法价格低廉[ 5, 6]。沈小明[ 7]、程苏云[ 8]运用TaqMan探针的RQ-PCR方法检测空肠弯曲菌和沙门菌。Tan、Shrestha等[ 9, 10]研究者分别用SYBR Green I 荧光PCR 和分子信标PCR 的方法,检测临床样本中的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,均取得了较好的结果。本研究应用结合型染料SYBR Green I ,对扩增产物进行连续监测,并通过温度的变化进行熔解曲线的分析[ 11]。此方法成本低,不需要合成探针,适合临床泌尿道感染样本大肠埃希菌的筛查,同时也通过设计单一特异性引物等手段避开了不利影响。本研究选择大肠埃希菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测靶基因设计引物,经对我院泌尿道感染患者最常见的肺炎克雷白杆菌、粪肠球菌等5种需氧菌验证,具有良好的特异性,满足临床泌尿道感染大肠埃希菌的特异性检测。

本研究中以标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)重组质粒DNA建立的标准曲线稳定性较好,且线性范围广(102 ~108拷贝/μL),选取的6株泌尿道感染患者中段尿样本中的大肠埃希菌DNA拷贝数均在此范围内,因此,该标准品所建标准曲线可满足临床需要,且重复性好,说明检测方法具有较好的稳定性。本研究对15 例经细菌培养的临床尿液样本(包括6株大肠埃希菌、 2株肺炎克雷伯菌、2株粪肠球菌、1株铜绿假单胞、1株阴沟肠杆菌和3株阴性样本)进行RQ-PCR 检测,结果表明,此方法能检测临床尿液样本中大肠埃希菌的感染情况。临界值的确定及拷贝数与尿液菌液浓度之间的关系,作者还正在进一步研究中。

总之,本研究建立了一种对泌尿道大肠埃希菌感染的感染程度或后果进行更准确、快速、敏感而且有效的评估方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

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