引用本文
全晖, 邓君. 荧光定量聚合酶链反应检测c-myc在乳腺癌诊断中的临床应用. 2011, 26(6): 361-363
QUAN Hui, DENG Jun. Theclinicalapplicationoffluorescentquantificationpolymerasechainreactiontodetectc-mycgeneinthediagnosisofbreastcancer. Labratory Medicine, 2011, 26(6): 361-363  
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《检验医学》编辑部
荧光定量聚合酶链反应检测c-myc在乳腺癌诊断中的临床应用
全晖1, 邓君2
1. 核工业四一六医院,四川成都 610051
2. 四川省人民医院,四川成都 610072

作者简介：全晖,男,1970年生,学士,副主任技师,主要从事分子生物学研究。

基金:2007年四川省杰出青年基金资助项目（2007-5-345）;
摘要
目的

建立荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测核内原癌基因c-myc表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。

方法

建立FQ-PCR法,并以β2-微球蛋白作为内对照测定30名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中c-myc的表达水平。

结果

c-myc表达水平在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义(P>0.05),乳腺癌组均高于前2组(P<0.05),β2-微球蛋白在3组间差异无统计学意义(P>0.05)。81例乳腺癌患者阳性率为40.7%,良性乳腺疾病组为0。c-myc表达水平与患者年龄和肿瘤大小和类型无关(P>0.05),与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关(P<0.05)。

结论

FQ-PCR技术是高灵敏度、高特异性的快速定量检测c-myc方法,可有效监测乳腺癌的诊断、疗效、转移和预后。

关键词: c-myc; 荧光定量聚合酶链反应; 乳腺癌
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)06-0361-03
Theclinicalapplicationoffluorescentquantificationpolymerasechainreactiontodetectc-mycgeneinthediagnosisofbreastcancer
QUAN Hui1, DENG Jun2
1. 416 HospitalofNuclearIndustry,SichuanChengdu 610051,China
2.SichuanProvincialPeople'sHospital,SichuanChengdu 610072,China
Abstract
Objective

To evaluate the clinical application of fluorescent quantification polymerase chain reaction (FQ-PCR) to detect the expression level of c-myc gene in the diagnosis of breast cancer.

Methods

The c-myc expression levels in the clinical samples of 30 healthy women, 30 patients with benign breast disease and 81 patients with breast cancer were detected by FQ-PCR. β2-microglobin was used as internal control.

Results

There was no statistical significance in c-myc expression level between healthy control group and benign breast disease group(P>0.05). The c-myc expression level in breast cancer group was higher than those in the other groups(P<0.05). There was no statistical significance in β2-microglobin among the 3 groups(P>0.05). The positive rates of breast cancer and benign disease groups were 40.7% and 0 respectively. No significant association of c-myc expression among age, tumor size and tumor type was noted (P>0.05),but its expression in breast cancer was correlated with clinical stage, histological grade and axillary metastatic lymph node (P<0.05).

Conclusions

FQ-PCR is a rapid, sensitive and specific method for quantitating c-myc gene. It also gives objective evidence to the diagnosis, therapy and metastasis of breast cancer.

Keyword: c-myc gene; Fluorescent quantification polymerase chain reaction; Breast cancer

核内原癌基因c-myc出现在早期的胚胎发育中,控制着细胞的生长、发育、分化和凋亡等,在多种肿瘤形成过程中处于重要地位[ 1, 2]。c-myc的异常表达与乳腺癌早期发生、发展和转移密切相关[ 3, 4]。本实验采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测健康女性体检者、良性乳腺疾病及乳腺癌患者在外周血中c-myc基因的表达水平,探讨其对乳腺癌诊断和疗效监测的应用价值。

材料和方法
一、对象

核工业四一六医院健康女性体检者30名,年龄25~65岁,30例良性乳腺疾病患者,年龄29~67岁,81例乳腺癌患者,年龄37~63岁,来自四川省人民医院门诊和住院患者,经病理学确诊,均为初诊者。30例良性乳腺疾病患者中17例为纤维瘤,13例为脂肪瘤,排除患其他肿瘤的可能性。81例乳腺癌中22例为乳腺单纯癌,40例为浸润性导管癌,15例为黏液癌,4例为不典型髓样癌。肿瘤分期参照国际抗癌联盟(UICC)的标准执行,其中7例为Ⅰ期,30例为Ⅱ期,35例为Ⅲ期,9例为Ⅳ期。根据标本的腺管形成和细胞核异形性及核分裂相计数分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级,分别为18例、22例和41例。39例有淋巴结及远处转移,42例无淋巴结转移。乳腺癌和良性乳腺疾病患者均于手术前1周内取晨血5 mL。

二、试剂和仪器

逆转录反应体系、FQ-PCR体系和β2-微球蛋白内对照试剂盒均来自美国ABI生物公司;7700 Sequence Detector 分析仪为美国ABI生物公司生产;cDNA标准品由上海申友公司合成。

三、FQ-PCR引物和探针

采用PE公司Primer Express软件设计c-myc的引物和探针,引物和探针序列:c-myc 正义引物5'- CCCAGCGAGGA(t/c)ATCTGGAAGAA-3',c-myc反义引物5'-GAGAAGCCGCTCCACAT(a/g)CAGTC-3';探针:5'- CCTGTGGTTGAATGAA -3'。羧基荧光素(FAM)荧光作为报告基团标记探针5'端,四甲基罗丹明荧光素(TAMRA)荧光为淬灭基团标记3'端。由上海基康生物公司合成。

四、FQ-PCR反应

1. 取静脉血5 mL,弃去开始的1 mL,以防上皮细胞的污染,1 mg/mL乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝,生理盐水稀释2~3倍,用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[ 5]提取细胞总RNA。

2. cDNA合成 逆转录反应体系20 μL,包括细胞总RNA 1 μg,随机引物200 ng,RNasin 20 U,5×逆转录反应缓冲液4 μL,莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶20 U。42 ℃反应55 min。

3. PCR 反应体系逆转录产物5 μL,寡聚核苷酸引物各为400 nmol/L,探针150 nmol/L,dATP、dCTP和dGTP各 200 μmol/L, dUTP 400 μmol/L,10×缓冲液5 μL,MgCl25 mmol/L,Taq DNA聚合酶 1.25U,尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5U。在7700 Sequence Detector 分析仪上测定标准品和标本c-myc和β2-微球蛋白含量。扩增参数为:50 ℃2 min,95 ℃10 min;再94 ℃30 s,66 ℃1 min,40个循环。根据标准曲线,仪器自动计算出标本中c-myc和β2-微球蛋白的拷贝数/mL,以c-myc和β2-微球蛋白比值作为c-myc的表达水平。

五、标准曲线制备方法

将人工合成的标准品10倍稀释,观察相关系数变化,确定线性范围为102~106拷贝/mL。

六、统计学方法

c-myc和β2-微球蛋白的测定结果和两者比值用 x-±2 s表示,每组间比较用 t检验。根据统计学分析[ 6],正常对照组 x-±2 s作为正常值范围,以c-myc和β2-微球蛋白高于正常对照组 x-±2 s为阳性。

结 果
一、各组c-myc基因表达水平的比较

c-myc表达水平在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义( P>0.05),在乳腺癌组均高于前2组( P<0.05), β2-微球蛋白在3组间差异无统计学意义( P>0.05),见 表1。

表1 3组和疾病组c-myc基因表达水平的比较( x-[±2 s)
二、c-myc癌基因表达与乳腺癌临床病理因素的关系

若以c-myc/β2-微球蛋白高于正常对照组 x-±2 s为阳性,81例乳腺癌患者的阳性数为33,阳性率40.7%,良性乳腺疾病组阳性数为0。c-myc表达与患者年龄和肿瘤大小和类型无关( P>0.05)。与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关( P<0.05),级别越高的肿瘤阳性率越高,各级之间阳性率差异有统计学意义( P<0.05),腋淋巴结转移者高于无转移者( P<0.05),见 表2。

表2 c-myc 癌基因表达与乳腺癌临床病理因素的关系
讨 论

c-myc基因位于第8号染色体长臂,编码与细胞增殖调控相关的转录因子,其异常表达与人类肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生有关,c-myc是原癌基因,活化的方式主要为染色体丢失和基因扩增,通过作用于细胞增殖及促细胞周期等靶基因使肿瘤细胞无限增殖,c-myc表达增强,意味着肿瘤细胞增殖能力增强,肿瘤生长快,易发生侵袭和转移。对于其基因表达的检测常采用免疫组化[ 1]、RT-PCR或竞争PCR等方法,不仅操作复杂费时,需用强诱变剂,只能半定量,而且可能出现假阳性[ 7]。 FQ-PCR法主要是利用Taq酶5'→3'外切酶活性,在常规PCR基础上加入荧光标记探针进行核酸定量分析,优点在于:(1)在PCR扩增对数期对mRNA的表达进行定量,结果更为可靠;(2)扩增和检测同时进行,减少了交叉污染;(3)高灵敏度、高特异性和高准确性;(4)高度自动化、快速,可缩短检测时间1~2 h。

本实验建立的FQ-PCR法检测了30名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者的外周血中c-myc的基因表达,并以β2-微球蛋白作为内对照,结果发现81例乳腺癌患者的阳性数为33,阳性率40.7%,良性乳腺疾病组阳性数为0。c-myc基因表达与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关,级别越高的肿瘤阳性率越高,各级之间阳性率差异有统计学意义,证实其可以作为判断乳腺癌预后的重要指标。在腋淋巴结阳性与阴性组中c-myc 表达阳性率分别为64.1%和38.1%,其表达与腋淋巴结转移有关( P<0.05),预示肿瘤细胞具有高的侵袭性行为和不良的预后。c-myc基因表达与患者年龄和肿瘤大小和类型无关。

综上所述,FQ-PCR法能快速定量检测外周血中c-myc的基因表达,具有高灵敏度、高特异性、高准确性、高效率和污染小等特点,而且标本来源容易,对于乳腺癌的诊断、治疗、转移和预后提供更为可靠客观的根据,是一种值得推荐的实验室诊断方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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