引用本文
周沐青, 刘鷖雯, 王颖智, 何怡青, 杨翠霞, 高锋. 荧光定量PCR检测VEGF-C、CEACAM-1在胃肠肿瘤中的表达及意义. 2011, 26(5): 299-305
ZHOU Muqing, LIU Yiwen, WANG Yingzhi, HE Yiqing, YANG Cuixia, GAO Feng. Expression and significance of VEGF-C and CEACAM-1 in gastroenteric carcinoma tissues by fluorescence quantitation polymerase chain reaction. Labratory Medicine, 2011, 26(5): 299-305  
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荧光定量PCR检测VEGF-C、CEACAM-1在胃肠肿瘤中的表达及意义
周沐青, 刘鷖雯, 王颖智, 何怡青, 杨翠霞, 高锋
上海交通大学附属第六人民医院中心实验室,上海 200233

作者简介：周沐青,女,1986年生,学士,主要从事临床检验工作。

通讯作者：高锋,联系电话：021-64369181-58702。

基金:上海市科委2010年度“科技创新行动计划”生物医药和农业科技领域重点科技项目资助（10411950500）;
摘要
目的

观察血管内皮生长因子C(VEGF-C)和癌胚抗原相关黏附分子1(CEACAM-1)在消化道癌组织和癌旁组织中的表达情况,探讨其表达与肿瘤分期的关系,与术前血清癌胚抗原(CEA)水平一起比较其在肿瘤诊断中的价值。

方法

采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测53例消化道肿瘤及相应癌旁对照组织中VEGF-C、CEACAM-1 mRNA表达水平;用全自动免疫发光分析仪测量患者术前血中CEA水平。

结果

VEGF-C mRNA在癌组织中的表达显著高于相应癌旁对照组织(P<0.05),均值分别为2.65E-03和1.63E-03;CEACAM-1 mRNA在癌组织和癌旁组织中表达差异无统计学意义(P>0.05),均值分别为0.036 2和0.066 4;VEGF-C、CEACAM-1 mRNA在癌组织及癌旁对照组织中均有显著相关性(P<0.001);癌组织中肿瘤侵润较深组其CEACAM-1 mRNA显著高于肿瘤侵润较浅组(P<0.05);癌组织VEGF-C mRNA诊断消化道恶性肿瘤的符合率较血清CEA高(P<0.001)。

结论

胃肠道肿瘤中CEACAM-1 和VEGF-C的表达量与肿瘤分期有关;VEGF-C mRNA在癌组织中的表达水平可作为胃肠恶性肿瘤的预测指标,也可在分子水平上作为判断胃肠肿瘤临床分期的辅助指标。

关键词: 血管内皮生长因子C; 癌胚抗原相关黏附分子1; 胃肠肿瘤; 实时荧光定量聚合酶链反应
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)05-0299-07
Expression and significance of VEGF-C and CEACAM-1 in gastroenteric carcinoma tissues by fluorescence quantitation polymerase chain reaction
ZHOU Muqing, LIU Yiwen, WANG Yingzhi, HE Yiqing, YANG Cuixia, GAO Feng
Department of Clinical Research Center,the Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China
Fund:
Abstract
Objective

To investigate the expressions of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) and carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1 (CEACAM-1) in gastroenteric carcinoma and pericarcinoma tissues and the relationship of the expressions and tumor stage, and evaluate the significance of serum carcinoembryonic antigen (CEA) level in tumor diagnosis before operation.

Methods

Real-time quantitation polymerase chain reaction(PCR) was performed to detect the expression of VEGF-C and CEACAM-1 mRNA in 53 cases of gastroenteric carcinoma and pericarcinoma tissues. The same patients' serum CEA levels before operation were measured by automatic chemiluminescent immunoassay analyzer.

Results

The VEGF-C mRNA level in gastroenteric carcinoma was significantly higher than that in corresponding pericarcinoma tissues (2.65E-03 and 1.63E-03, P<0.05).There was no significant difference of the CEACAM-1 mRNA level between carcinoma and pericarcinoma tissues (0.036 2 and 0.066 4,P>0.05). The level of VEGF-C mRNA correlated with that of CEACAM-1 mRNA in carcinoma and pericarcinoma tissues (P<0.001). The expression of CEACAM-1 mRNA in gastroenteric carcinoma from patients with deep invasion was significantly higher than that from patients with low invasion (P<0.05). The coincidence rate of carcinoma tissue VEGF-C mRNA in the diagnosis of digestive tract malignant tumor was higher than that of serum CEA (P<0.001).

Conclusions

The expression levels of CEACAM-1 and VEGF-C mRNA in gastroenteric carcinoma are correlated with tumor stage. The VEGF-C mRNA level may be a useful marker for predicting gastroenteric carcinoma and judging the clinical stage of gastroenteric carcinoma.

Keyword: Vascular endothelial growth factor-C; Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1; Gastroenteric carcinoma; Real-time fluorescence quantitation ploymerase chain reaction

消化道肿瘤是我国最常见的恶性肿瘤之一,我国每年新发现40万胃癌患者、15万结直肠癌患者。探索经济有效的检测方法,早期诊断肿瘤患者,显得十分紧要和迫切。目前肿瘤的诊断指标很多,传统指标有血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)等。这些指标的敏感性及特异性存在一定缺陷[ 1],因此分子核酸水平上的诊断指标成为探索热点,可与传统指标一起作为肿瘤TNM分期的有益补充。血管内皮生长因子C(VEGF-C)选择性高表达于肿瘤细胞,正常黏膜和间质不表达;癌胚抗原相关黏附因子1(CEACAM-1)在肿瘤不同时期表达有所不同,是新的潜在指标之一,国内外报道较少。本研究采用荧光定量聚合酶链反应(PCR),检测不同转移及分期情况的胃肠道恶性肿瘤患者癌组织及其相应癌旁组织VEGF-C和CEACAM-1的表达水平,并与术前血清CEA水平作对比分析,探讨VEGF-C及CEACAM-1在胃肠道恶性肿瘤诊断及临床监控中的价值。

材料和方法
一、材料

1. 患者和肿瘤标本 收集2009年12月至2010年4月于上海交通大学附属第六人民医院普外科接受手术治疗及术后病理诊断明确的原发性胃肠道恶性肿瘤患者53例(男33例,女20例,年龄29~84岁),其中肠道肿瘤26例,胃肿瘤27例。术前均未接受放化疗及其他治疗。术中在肿瘤原发灶取癌组织标本及相应癌旁组织(距原发癌4 cm以外并避开炎症及坏死部位),生理盐水简单冲洗后迅速投入液氮,30 min后转至-80 ℃冰箱冷冻保存。所有入选患者均经临床及病理证实符合恶性肿瘤诊断标准,临床及病理资料完整。

2. 主要试剂与仪器 Trizol试剂(Invitrogen life technologies 公司);焦碳酸二乙酯(BIO BASIC有限公司);逆转录试剂盒;SYBR real time PCR试剂盒及150 bp DNA Ladder Marker (宝生物工程大连有限公司),逆转录-PCR(RT-PCR)引物由上海英骏生物技术有限公司合成;ARCHITECT CEA试剂盒(6C02);PCR扩增仪(德国Eppendorf公司);紫外分光光度计(德国Eppendorf公司);Lightcycler荧光定量PCR仪(Roche公司);ARCHITECT i 2000SR全自动免疫发光分析仪(美国雅培公司)。

二、方法

1. 总RNA抽提和cDNA合成 取组织50~100 mg,采用Trizol试剂一步法提取总RNA。经检测纯度与含量,并用1%琼脂糖凝胶100 V 30 min电泳检测RNA完整性,而后RNA存于-80 ℃备用。取总RNA 1 μg,PCR扩增仪上制备cDNA(20 μL体系)。反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。

2. 实时定量PCR 采用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)做内参照基因,Lightcycler荧光定量PCR反应体系20 μL,包括: SYBR®Premix Ex TaqTM 10 μL,10 μmol/L上下游引物(见 表1)各0.4 μL,模板cDNA 2 μL,双蒸水(ddH2O)7.2 μL。反应条件:预变性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,单点检测荧光信号(single),40个循环PCR反应;所有标本均做复孔及空白对照。

表1 VEGF-C、CEACAM-1及GAPDH引物序列、扩增片段长度

3. 标准曲线的制备 采用与定量PCR相同引物,在普通PCR仪上50 μL反应体系扩增组织cDNA,产物经过10×、100×、1 000×、10 000×、100 000×梯度稀释后用做定量PCR模板,在定量PCR仪上采用前述条件检测VEGF-C、CEACAM-1、GAPDH mRNA表达。同样加入复孔及阴性对照。分别以浓度的对数和复孔平均Ct值为横、纵坐标作图,得标准曲线,根据曲线斜率和相关系数验证定量PCR反应是否具有良好的扩增效率及Ct值与模板量的线性关系。

4. 患者术前血清CEA水平检测 采用化学发光微粒子免疫分析(CMIA)技术,在雅培公司ARCHITECT i 2000SR全自动免疫发光分析仪上进行分析,两步法对患者术前血清中的CEA进行定量测定。参考值以>10 ng/mL为异常增高。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0 for Windows软件分析数据,以2-△Ct(-△Ct=内参基因Ct-目的基因Ct)表示癌组织及癌旁组织标本中VEGF-C、CEACAM-1、GAPDH mRNA的量;癌组织标本与其相应癌旁组织标本比较采用非参数统计中配对设计资料Wilcoxon符号秩和检验;癌组织内部不同分组比较采用非参数统计的两独立样本检验方法(Mann-Whitney检验)。采用Spearman秩相关分析法和Pearson卡方检验法分别做两指标的相关性分析及比较VEGF-C mRNA和血清CEA水平对胃肠道恶性肿瘤的检出率。 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、实时PCR反应方法的验证

采用与定量PCR相同引物,在普通PCR仪上20 μL反应体系扩增的组织cDNA,产物经系列稀释后用做定量PCR模板,检测VEGF-C、CEACAM-1、GAPDH mRNA表达。所得标准曲线斜率分别为-3.433、-3.403和-3.379;相关系数均为-1.00,表明VEGF-C、CEACAM-1、GAPDH mRNA在本试验条件下扩增效率在100%左右,模板量与Ct值有良好的相关性,可以作为依据进行这3个分子mRNA在组织中表达差异的分析工作。3个分子定量PCR的溶解曲线分别见 图1~3,产物实际Tm值与预期一致。 定量PCR扩增结束后收集产物,2%葡聚糖凝胶,恒压85 V 45 min电泳,结果见 图4。可见实际扩增产物片段长度与试验设计一致,结果可信。

图1 VEGF-C定量PCR溶解曲线

图2 CEACAM-1定量PCR溶解曲线

图3 GAPDH定量PCR溶解曲线

图4 荧光定量PCR电泳图

二、VEGF-C mRNA和CEACAM-1 mRNA实时定量PCR结果

VEGF-C mRNA在所有组织标本中均有检出(Ct值<30)。癌组织标本VEGF-C mRNA显著高于相应癌旁组织,差异有统计学意义( Z=-2.474, P=0.013);年龄≥60岁组其癌组织VEGF-C mRNA显著低于<60岁组,差异具有统计学意义( Z=-2.201, P=0.028);淋巴结转移组与未转移组、肿瘤浸润较深组与肿瘤浸润较浅组相比,差异无统计学意义;VEGF-C mRNA表达与患者性别无关。

CEACAM-1 mRNA在所有组织标本中均有检出(Ct值<30),其中癌组织的表达与相应癌旁组织的表达差异尚不具有统计学意义( Z=-1.421, P=0.155);同一患者癌组织CEACAM-1的表达量与癌旁组织相同;肿瘤浸润较深组其CEACAM-1 mRNA显著高于浸润程度较浅组,差异有统计学意义( Z=-2.057, P=0.040)。在参与本次研究的肿瘤患者中, CEACAM-1 mRNA表达与淋巴结转移、年龄、性别等因素无关。见 图5、6和 表2、3。

图5 胃肠恶性肿瘤VEGF-C mRNA在癌组织及癌旁组织中的表达情况

图6 胃肠恶性肿瘤CEACAM-1 mRNA在癌组织及癌旁组织中的表达情况

表2 胃肠恶性肿瘤VEGF-C mRNA与临床病理的关系
表3 胃肠恶性肿瘤CEACAM-1 mRNA与临床病理的关系
三、VEGF-C与CEACAM-1 mRNA的相关性

针对同一标本来源的cDNA模板,本研究均在相同条件下做复孔同时检测VEGF-C及其受体VEGFR-3,模板量相同,因此比较同一标本VEGF-C、CEACAM-1 mRNA表达比例,可以不引入内参基因Ct值而直接应用VEGF-C、CEACAM-1的平均Ct值表示mRNA的量,癌组织与癌旁组织中VEGF-C mRNA与CEACAM-1 mRNA均呈显著相关( r=0.469、0.580, P<0.001)。

四、VEGF-C mRNA在癌组织中表达与血清CEA含量的相关性比较

使用相对定量法以癌组织比癌旁组织VEGF-C mRNA的2-△△CT≥1(癌组织中VEGF-C mRNA含量高于相应癌旁组织)为阳性诊断阈值,53例胃肠道肿瘤患者中,34例为阳性,19例为阴性;以血清CEA>10 ng/mL为诊断阈值,53例胃肠道肿瘤患者中,只有13例为阳性,40例为阴性。提示癌组织VEGF-C mRNA诊断胃肠道恶性肿瘤的符合率(指标异常的胃肠癌患者与全部胃肠癌患者的比例)较血清CEA高,且差异有统计学意义( χ2=16.858, P=0.000; Kappa=-0.396, P=0.000)。见 表4。

表4 VRGF-C mRNA与血清CEA对胃肠道恶性肿瘤诊断符合率的比较(例)
讨 论

VEGF-C能增加脉管的通透性并能促进内皮细胞移动和增生,发挥趋化作用,使得内皮细胞朝向VEGF-C浓度高的肿瘤细胞伸出伪足,同时扩大管腔并易化肿瘤细胞侵入[ 2](淋巴管为主要作用靶点)。体内外大量研究表明,VEGF-C的表达与肿瘤脉管侵袭、淋巴管浸润、淋巴结转移、远处转移甚至预后呈正相关。而使用可溶性VEGFR-3捕获抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂及VEGFR-3抗体等途径阻断VEGF-C/VEGFR-3信号通路,已证实可抑制肿瘤淋巴管新生及相关淋巴结转移[ 3, 4]。

CEACAM-1又称BGP、C-CAM、CD66a,属于CEA家族,是细胞表面跨膜糖蛋白,也是介导细胞与细胞之间连接的受体,表达在某些上皮、内皮及骨髓来源的细胞表面。最初在胆道中因其能与抗CEA抗体发生交叉反应而被发现[ 5], CEACAM-1的生物学活性较多,包括抑制肿瘤生长和上皮细胞增殖,诱导上皮细胞凋亡,推迟粒细胞和单核细胞的凋亡,抑制T细胞的增殖和活化,刺激B细胞的增殖,抑制T细胞和自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性作用,促进肿瘤细胞侵袭及内皮细胞运动,促进血管生成并调节内皮结构[ 6~ 8]等。

因 CEACAM-1能抑制增殖,并在肿瘤发生后降低,早期多将其作为抑癌分子。但新近Kilic 等[ 9]对前列腺癌、膀胱癌的研究表明,正常组织CEACAM-1仅表达在上皮细胞,淋巴内皮细胞不表达,但肿瘤边缘(<0.5 cm)的小淋巴管同时表达CEACAM-1和淋巴内皮标记物podoplanin(肾小球足突细胞膜蛋白),有些尚未表达淋巴内皮标记物的幼稚细胞甚至仅表达CEACAM-1,而原位癌的研究发现CEACAM-1在淋巴内皮上的表达先于肿瘤细胞侵入管腔,提示在肿瘤形成及演进中,CEACAM-1可能通过改变分布部位并促进内皮细胞分化成熟,从而促进肿瘤细胞侵袭脉管系统,协助肿瘤播散。因而CEACAM-1与肿瘤的关系可能不局限于抑癌。

本研究通过实时定量PCR,探讨胃肠肿瘤组织中的VEGF-C mRNA、CEACAM-1 mRNA水平及其相互关系。通过分析53例恶性胃肠肿瘤组织,发现VEGF-C mRNA、CEACAM-1 mRNA的表达量与患者的性别无关,但年龄≥60岁组其癌组织VEGF-C mRNA显著低于<60岁组,并且差异有统计学意义( Z=-2.201, P=0.028),说明随着年龄的增加,VEGF-C表达量降低,可能与机体整体新陈代谢水平随着年龄增加而减弱有关。而淋巴结转移的肿瘤组织其VEGF-C mRNA、CEACAM-1 mRNA与未发生淋巴结转移的组织相比,差异无统计学意义( P>0.05),与报道不符[ 10, 11],这可能与组织成分复杂及患者内部差异等原因有关。而癌组织VEGF-C mRNA较其相应癌旁组织显著增加,且差异有统计学意义( Z=-2.474, P=0.013),提示细胞恶变后VEGF-C表达增多,与文献报道相一致[ 12, 13]。CEACAM-1 mRNA在癌组织的表达量较其对应癌旁组织低,但差异尚不具有统计学意义。浸润程度深的癌组织其CEACAM-1 mRNA表达显著高于浸润程度低的癌组织,且差异有统计学意义。提示CEACAM-1在肿瘤不同时期所起的主要作用不同,可能是由于癌晚期播散倾向较早期放缓,并且定植后需要CEACAM-1等细胞黏附分子加强肿瘤上皮细胞之间的黏附,共同抵抗宿主对其杀伤作用,因而浸润后期肿瘤细胞的CEACAM-1表达较早期增加。以上假说需要结合组化观察进一步验证。

应用Spearman相关分析方法比较同一患者癌组织和癌旁组织标本中VEGF-C mRNA和CEACAM-1 mRNA,发现不论癌组织还是癌旁组织其VEGF-C mRNA和CEACAM-1 mRNA都呈显著性相关,与Kilic等[ 9]和陈锡美等[ 11]报道相符。综合以上观察,我们推测这可能是因为肿瘤发生后,作为细胞间黏附分子的CEACAM-1在上皮细胞表达减少而在脉管内皮细胞表达增加,同时伴随VEGF-C等内皮细胞生长因子增加(二者可能通过目前未知途径互为因果),降低肿瘤细胞(上皮-上皮)之间同质性黏附的同时增加肿瘤细胞与内皮细胞(上皮-内皮)的异质性黏附。而VEGF-C作为公认的促淋巴管、血管新生及重构因子,可以促进脉管新生、扩大原有管腔,两者协同使得肿瘤细胞更容易通过现有或新生脉管系统发生转移,从而为肿瘤的演变、发展提供方便。但由于CEACAM-1较为复杂甚至矛盾的功能,VEGF-C/CEACAM-1相互作用可能与细胞所处的状态、CEACAM-1的表达量、甚至CEACAM-1亚型的比例有关。

本研究以VEGF-C mRNA 2-△△CT值≥1为阳性诊断阈值(即癌组织中VEGF-C mRNA量高于癌旁组织,细胞恶变后VEGF-C mRNA的量增加),其对胃肠道恶性肿瘤的检出率显著高于术前血清CEA 水平,且差异具有统计学意义( χ2=16.858, P=0.000)。提示应用以组织VEGF-C mRNA 2-△△CT≥1为诊断阈诊断胃肠道恶性肿瘤,其敏感性优于传统血清CEA检测方法。如能结合胃肠道良性疾病患者和正常人群组织标本,更能从特异性等方面多角度验证其检验效力,判别是否可为临床所用。

综上所述,检测VEGF-C基因及蛋白水平在癌组织中的表达,相关报道较多,但检测CEACAM-1分子在胃肠道肿瘤中的表达,相关报道极少。本研究应用定量PCR检测恶性肿瘤患者新鲜组织中VEGF-C mRNA及CEACAM-1 mRNA的表达并分析二者在肿瘤演进中的作用,发现组织VEGF-C mRNA水平增高可作为胃肠恶性肿瘤发生及进展的指标,其敏感性优于传统血清CEA指标;而癌组织中CEACAM-1 mRNA表达与癌旁组织尚无差异,但癌组织中浸润程度较深组其CEACAM-1表达较较浅组高,对临床也有积极提示意义。结合前人报道及本研究结果,我们认为VEGF-C和CEACAM-1在肿瘤发生、发展过程中可能相互影响、互为因果,起到促进肿瘤侵袭演进的作用。后期需要扩大肿瘤标本种类及数量并增加良性病理变化、跟踪患者病情,进一步论证,以期为肿瘤的临床诊断提供新的选择。

The authors have declared that no competing interests exist.

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