引用本文
林萍, 孙阳, 韩立中, 张祎博. 杀白细胞素pvl基因阴性MRSA对抗菌药物的耐药性研究. 2011, 26(5): 295-298
LIN Ping, SUN Yang, HAN Lizhong, ZHANG Yibo. Study on the resistance of pvl gene-negative MRSA to antimicrobial drugs. Labratory Medicine, 2011, 26(5): 295-298  
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杀白细胞素pvl基因阴性MRSA对抗菌药物的耐药性研究
林萍1, 孙阳2, 韩立中3, 张祎博3
1. 上海交通大学医学院附属精神卫生中心临床检验科,上海 200030
2. 同济大学医学院附属同济医院医学科学研究所,上海 200065
3. 上海交通大学医学院附属瑞金医院微生物科,上海 200025

作者简介：林萍,女,1968年生,硕土,副主任技师,主要从事临床医学检验工作。

基金:上海市闵行区科委资助项目(2005-05);
摘要
目的

研究杀白细胞素(PVL)pvl基因阴性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对多种抗菌药物的耐药性。

方法

采用头孢西丁纸片扩散法检测MRSA;用聚合酶链反应(PCR)检测mecA基因及pvl基因;采用琼脂稀释法测定金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(MIC)并检测pvl基因阴性MRSA对12种抗菌药物的耐药性。

结果

71株金黄色葡萄球菌中检测出33株pvl基因阴性MRSA,检出率为46.4%(33/71);对青霉素类抗菌药物的耐药率为100.0%;对其他类抗菌药物呈多重耐药并以ECLOTGMP为主要耐药模式,占66.7%(22/33);未发现对达托霉素、替考拉宁和万古霉素耐药的菌株。

结论

医院感染中以pvl基因阴性MRSA为主,并呈现多重耐药;pvl基因阴性MRSA主要耐药模式为对红霉素、环丙沙星、克林霉素、苯唑西林、四环素、庆大霉素、复方磺胺甲口恶唑和青霉素耐药,是主要流行株,要谨慎使用以上8种抗菌药物。

关键词: 杀白细胞素; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 耐药性
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)05-0295-04
Study on the resistance of pvl gene-negative MRSA to antimicrobial drugs
LIN Ping1, SUN Yang2, HAN Lizhong3, ZHANG Yibo3
1. Department of Clinical Laboratory, Shanghai Mental Health Center, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200030, China
2. Institute of Medical Sciences, Tongji Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200065, China
3. Department of Microbiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Fund:
Abstract
Objective

To investigate the resistance of panton-valentine leukocidin (PVL) pvl gene-negative methicillin-resistantStaphylococcus aureus (MRSA) to antimicrobial drugs.

Methods

Cefoxitin disk diffusion test was used to detect MRSA. Polymerase chain reaction (PCR) was used to the detection of mecA gene and pvl gene. The minimum inhibitory concentration (MIC) of MRSA was detected by agar dilution, and the resistance of pvl gene-negative MRSA to 12 antimicrobial drugs was detected.

Results

33 pvl gene-negative MRSA were detected from 71 strains ofStaphylococcus aureus. The detection rate was 46.4% (33/71). The resistance rate of penicillin was 100%, and other antimicrobial drugs showed multiple drug resistance. The main resistance patterns accounting for 66.7% (22/33) was showed the resistance of ECLOTGMP. The resistant strains to daptomycin, teicoplanin and vancomycin were not found.

Conclusions

The pvl gene-negative MRSA with resistance to erythromycin, ciprofloxacin, clindamycin, tetracycline, gentamicin, sulphamethoxazole, oxacillin and penicillin may be the most popular, which is the multidrug resistance pattern of major epidemic strains. These 8 antimicrobial drugs should be used carefully.

Keyword: Panton-valentine leukocidin; Methicillin-resistantStaphylococcus aureus; Resistance

近年来,世界范围内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染率大大增加[ 1, 2]。MRSA既可由感染患者携带入院,也可因抗菌药物的使用在医院内产生[ 3, 4]。国外研究发现,医院获得性MRSA(HA-MRSA)与社区获得性MRSA(CA-MRSA)在流行范围和生物学特性[如葡萄球菌染色体mec基因盒(SCCmec)、毒素种类、耐药模式等]上有显著不同,尤其是杀白细胞素(panton-valentine leukocidin,PVL)多由CA-MRSA产生[ 5],医院感染中以pvl基因阴性MRSA为主。本研究对临床分离的金黄色葡萄球菌进行mec基因检测以筛检MRSA,同时采用聚合酶链反应(PCR)对MRSA进行pvl基因检测;并对pvl基因阴性的MRSA进行多种抗菌药物敏感性试验,以了解医院pvl基因阴性MRSA的多重耐药模式,分析耐药机制,为医院感染控制提供依据。

材料和方法
一、材料

1.试验菌株 2006年2月至2007年8月上海瑞金集团闵行医院临床标本中分离的金黄色葡萄球菌71株;质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、已知MRSA及金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)。

2.抗菌药物 苯唑西林、复方磺胺甲口恶唑、庆大霉素、四环素、万古霉素、替考拉宁、青霉素、红霉素、环丙沙星、克林霉素、利福平均为上海市药品检验所提供;达托霉素、药敏纸片红霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、头孢西丁(30 μg)均 购自Oxoid公司。

3. 培养基 血平板、Muller-Hinton药敏培养基购于法国生物梅里埃公司;营养琼脂由上海市疾病预防控制中心提供;菌种保存培养基(30%甘油肉汤,自配)。

4. 试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒、溶菌酶、PCR扩增 TaqDNA酶、dNTP 、10×PCR缓冲液及Mg2+、DNA Marker均由上海生工工程公司提供;长片段PCR扩增LA TapDNA酶、dNTP、 10× LA PCR缓冲液及Mg2+、DL 2000 Maker均由TaKaRa公司提供。

5. PCR引物 基因扩增引物由博彩公司合成,见 表1。

表1 mecA基因与pvl基因检测引物序列

6.主要仪器 多点接种仪、恒温培养箱、电热恒温水槽、恒温摇床、低温冰箱、TA-2R台式低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、GIS-2010凝胶成像系统。

二、方法

1. MRSA检测 头孢西丁纸片扩散法检测MRSA 参照2009美国临床实验室标准化研究所(CLSI)文件M100-S19[ 6]判定敏感、耐药和中介。头孢西丁抑菌圈直径≤21 mm判断为MRSA;抑菌圈直径≥22 mm为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。

2. DNA的提取 参照文献[7]改良的碱裂解法提取金黄色葡萄球菌DNA。

3. PCR检测mecA基因 参照文献[8]PCR扩增反应体系和条件检测mecA基因。扩增产物电泳后凝胶成像仪观察结果并拍照保存。

4. PCR检测pvl基因 参照文献[9]PCR扩增反应体系和条件进行pvl基因扩增。扩增产物电泳后凝胶成像仪观察结果并拍照保存。

5.最低抑菌浓度(MIC)检测 采用琼脂稀释法测定pvl基因阴性MRSA的MIC。

结 果
一、 MRSA的检出率

71株金黄色葡萄球菌中有33株对头孢西丁耐药,MRSA的检出率为46.4%(33/71)。

二、mecA基因检测结果

mecA基因扩增片段为533 bp,71株金黄色葡萄球菌中有33株mecA基因阳性,结果见 图1。

图1 MRSA的mecA基因扩增结果

三、pvl基因检测结果

33株MRSA中均未检测到pvl基因。

四、MRSA的MIC测定结果

33株pvl基因阴性MRSA对青霉素、苯唑西林的耐药率为100.0%;对庆大霉素、克林霉素和复方磺胺甲口恶唑的耐药率分别为98.6%、97.9%和97.0%;对红霉素、环丙沙星和四环素的耐药率均在85.0%以上,;对利福平的耐药率为9.1%;未发现对达托霉素、替考拉宁和万古霉素耐药的菌株。33株pvl基因阴性MRSA对12种抗菌药物的药敏结果见 表2;7种耐药模式见 表3。

表2 33株pvl阴性MRSA对12种抗菌药物的药敏结果
表3 33株pvl基因阴性MRSA耐药模式
讨 论

MRSA是医院感染的主要病原菌,已成为世界范围内耐药性监测和医院感染预防和控制的重点[ 10]。本研究中,感染MRSA患者的男、女比例为22∶13;年龄构成比中≥60岁者居多,占40%;有侵入性操作的占60%以上。本研究71株金黄色葡萄球菌中检测出MRSA 33株,占46.4%,与文献报道的上海及其他地区MRSA分离率高达40%~70%以上[ 11]相比检出率稍低,可能因为患者大多遭受手术、静脉置管等侵入性操作,住院时间长且同时使用了大量的抗菌药物,破坏了人体正常防御机制[ 12]。另外,33株MRSA pvl基因呈阴性,表明绝大多数MRSA来源于住院患者。

本研究药敏结果可见,pvl基因阴性MRSA对临床常用多类抗菌药物耐药率较高,呈多重耐药,对青霉素类100%耐药,对氨基糖苷类、林可酰胺类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类也有较高的耐药率。因此,在临床上确定有医院获得性MRSA感染时,应谨慎使用以上几类抗菌药物。pvl阴性MRSA对糖肽类100%敏感,万古霉素被当作治疗MRSA的最后一线药物,应防止MRSA基因突变或转移而产生耐和中介万古霉素金黄色葡萄球菌。本试验使用的替考拉宁MIC90为4 μg/mL,达托霉素MIC90为2 μg/mL,MRSA对这2种药物均100%敏感。

分析药敏结果得到7种耐药模式,其中以ECLOTGMP耐药模式即红霉素、环丙沙星、克林霉素、苯唑西林、四环素、庆大霉素、复方磺胺甲口恶唑、青霉素为主,占66.7%(22/33);有3株耐药模式为ECLOTGMRP的pvl基因阴性MRSA除了对达托霉素和糖肽类抗菌药物敏感外,对其他抗菌药物均耐药,占9.1%(3/33)。通过对耐药谱的分析,提示HR-MRSA多重耐药性相当严重,应避免经验用药。分析耐药模式发现30株pvl基因阴性MRSA对红霉素和克林霉素均耐药,3株对红霉素敏感菌株对克林霉素均耐药,未发现对红霉素耐药而对克林霉素敏感的MRSA。值得关注的是,临床上可能因红霉素诱导克林霉素耐药而导致治疗失败[ 13],实验室对红霉素耐药而对克林霉素敏感的MRSA应进行D试验。

医院感染中以pvl基因阴性MRSA为主,并呈现多重耐药。以ECLOTGMP为主要耐药模式即对红霉素、环丙沙星、克林霉素、苯唑西林、四环素、庆大霉素、复方磺胺甲口恶唑和青霉素呈多重耐药的MRSA是医院主要流行株,也是感染控制的重点。

The authors have declared that no competing interests exist.

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