引用本文
单晶辉, 李宁, 关振宏, 段铭, 卢强, 刘红全, 孟锐奇, 张茂林. 一种稳定、灵敏且适用于ELISA的四甲基联苯胺底物. 2011, 26(4): 260-262
SHAN Jinghui, LI Ning, GUAN Zhenhong, DUAN Ming, LU Qiang, LIU Hongquan, MENG Ruiqi, ZHANG Maolin. A stable and sensitive tetramethyl benzidine substrate for ELISA. Labratory Medicine, 2011, 26(4): 260-262  
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一种稳定、灵敏且适用于ELISA的四甲基联苯胺底物
单晶辉1, 李宁1, 关振宏1, 段铭1, 卢强1, 刘红全2, 孟锐奇2, 张茂林1
1. 人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林大学人兽共患病研究所,吉林 长春 130062
2. 广西民族大学化学与生态工程学院,广西 南宁 530006

作者简介:单晶辉,女,1987年生,学士,主要从事抗病毒性免疫研究。

通讯作者:张茂林,联系电话:0431-87836715。

基金:吉林省科技发展计划重点项目(20080930); 吉林大学农学部引进人才科研启动基金资助项目(4305050102C1); 广西科学基金资助项目[桂科(自)0728057]
摘要
目的

评价一种适用于酶联免疫吸附试验(ELISA)的即用型自制四甲基联苯胺(TMB)底物的特性。

方法

比较1-Step Turbo TMB底物、A/B两组分混合物底物和自制底物与不同稀释度酶标抗体的反应性及其对包被抗体的检测敏感性,对1-Step Turbo TMB底物和自制底物进行稳定性比较。

结果

3种底物的吸光度( A)值均随着酶标抗体稀释度的增大而显著下降;当酶标抗体稀释度相同时,自制底物的 A值显著高于另外2种底物( P<0.05);在直接ELISA条件下,自制底物对包被抗体的检测敏感性可达15.63 ng/mL;自制底物37 ℃贮存60 d后的 A值仍高于1-Step Turbo TMB底物37 ℃贮存5 d的 A值。

结论

该即用型自制TMB底物在检测敏感性及稳定性上优于1-Step Turbo TMB底物。

关键词: 四甲基联苯胺底物; 稳定; 灵敏; 酶联免疫吸附试验
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)04-0260-03
A stable and sensitive tetramethyl benzidine substrate for ELISA
SHAN Jinghui1, LI Ning1, GUAN Zhenhong1, DUAN Ming1, LU Qiang1, LIU Hongquan2, MENG Ruiqi2, ZHANG Maolin1
1. Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education,Institute of Zoonosis, Jilin University, Jilin Changchun 130062, China
2.College of Chemistry and Ecology Engineering,Guangxi University for Nationalities, Guangxi Nanning 530006,China
Abstract
Objective

To evaluate a self-made ready to use tetramethyl benzidine (TMB) substrate for enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).

Methods

1-Step Turbo TMB substrate, A/B two-component TMB substrate and a self-made ready to use TMB substrate were applied. The reactivity against different dilution conjugated antibodies, the sensitivity for coated primary antibodies and the stabilities of 1-Step Turbo TMB substrate and self-made TMB substrate were compared,respectively.

Results

The result data showed that absorbance ( A) values of the 3 substrates decreased greatly along with the dilution of the conjugated antibodies,and the A value of self-made substrate was significantly higher than those of other 2 kinds of substrates ( P<0.05).The sensitivity for the self-made substrate with the coated antibodies by direct ELISA was 15.63 ng/mL, which was lower than those for the other 2 substrates. The A values of the self-made substrate after 60 d at 37 ℃ were even higher than that of 1-Step Turbo TMB substrate after 5 d under the same temperature.

Conclusions

The self-made TMB substrate is more sensitive and stable than 1-Step Turbo TMB substrate.

Keyword: Tetramethyl benzidine substrate; Stability; Sensitivity; Enzyme-linked immunosorbent assay
引言

邻苯二胺(OPD)和3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)等可作为提高检测敏感性的发色剂[1]。OPD对人和动物具致癌性, 但TMB不仅致癌性降低, 而且敏感性高, 因此已被广泛应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 [2, 3]。众所周知, 当TMB 和过氧化氢处于同一溶液体系时, 因发生氧化而失去活性。为此, Frey等[4]分别制备了TMB和过氧化氢的贮存液(A/B两组分), 通过现场混合, 较好地解决了TMB底物的敏感性和稳定性问题, 该技术目前在国内仍被广泛采用。在ELISA检测过程中, A/B两组分底物与即用型底物相比, 不仅使操作复杂化, 而且还增加了系统误差。目前国外已有多个商品化的即用型TMB底物溶液面市。为克服国内诊断试剂研究领域的这一技术瓶颈, 本研究制备了一种即用型TMB底物溶液, 并对其特性进行了检测。

材料和方法
一、主要材料

聚苯乙烯塑料板酶标板(NUNC); TMB、人IgG和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG购于Sigma公司; 柠檬酸、Na2HPO4· 12 H2O、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、无水乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、过氧化氢尿素等均购于上海生工公司; 1-Step Turbo TMB底物溶液购于Pierce公司。TMB底物溶液(A和B)来源于万泰公司。

二、方法

1. TMB底物溶液的配制

配制 0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH值5.0)。取850 mL此缓冲液, 将100 mg过氧化氢尿素加到其中, 待充分溶解后, 于4 ℃贮存1周, 然后缓慢加入PVP, 使其浓度至0.3%(W/V), 然后4 ℃过夜, 次日加入事先用DMSO和无水乙醇按体积比1∶ 10混合液溶解并避光保存的100 mg TMB, 最后加入2%(W/V)PEG, 并将总体积定容到1 000 mL, 4 ℃避光保存即可。

2. 底物溶液的特性检测

(1) 对不同稀释度的酶标抗体的反应:在96孔酶标板上, 用含0.1%BSA的吐温-磷酸盐缓冲液(PBST)将HRP标记的山羊抗人IgG按10 000、20 000、40 000、80 000、160 000、320 000、640 000倍的梯度进行稀释, 以0.1%BSA的PBST为对照, 每孔100 μ L, 然后每个酶标抗体稀释度分别加入100 μ L的1-Step Turbo TMB底物、A/B液等量混合底物和自制底物; 每种组合设6个重复, 室温避光反应20 min, 硫酸终止后450 nm下测定; (2)应用包被抗体检测底物的敏感性:在96孔酶标板上, 将人IgG用包被缓冲液稀释到1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25和16.75 ng/mL, 然后按常规包被, 以只加正常包被液的孔为对照。用含0.1%BSA的PBST封闭, 与40 000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG反应后, 分别用上述3种底物显色。每种组合设6个重复, 同上反应并终止后测定; (3)底物的稳定性: 将自制底物溶液和1-Step Turbo TMB底物溶液分别小量分装, 然后置于37 ℃ 0、3、5、7、14、30、60 d, 在96孔酶标板上与40 000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG反应, 评价底物的稳定性。

三、统计学方法

应用SPSS 10.0统计软件中的广义线性模型进行多组间统计学分析。

结果
一、底物与不同稀释度酶标抗体的反应

3种底物与不同稀释度酶标抗体反应的吸光度(A450 nm)值随着稀释度的增大而显著下降。在相同稀释度下, 自制底物的A值均显著高于另外2种底物的A值(P< 0.05)。见图1。

图1 3种底物对不同稀释度酶标抗体的反应性

二、应用包被抗体检测底物的敏感性

3种底物A450 nm值随着包被抗体浓度的减小而显著下降; 在相同稀释度下, 包被抗体浓度< 31.25 ng/mL时, A/B混合物底物和1-Step Turbo TMB底物A值与阴性对照间差异无统计学意义(P> 0.05); 而自制底物, 在相同条件, 甚至包被抗体浓度达15.63 ng/mL时, A值均显著高于前2种底物(P< 0.05), 并与阴性对照间差异有统计学意义(P< 0.01)。见图2。

图2 3种底物对包被抗体检测敏感性的反应性

三、底物的稳定性

1-Step Turbo TMB底物和A/B混合物底物溶液于37 ℃的A值均随着贮存时间地延长而逐步减小。自制底物在37 ℃贮存5 d的A值与1-Step Turbo TMB底物4 ℃(即1-Step Turbo TMB底物0 d)的A值相当, 自制底物37 ℃贮存60 d后的A值仍高于1-Step Turbo TMB底物37 ℃贮存5 d的A值。见图3。

图3 2种底物的稳定性检测

讨论

TMB底物以高敏感性和低致癌性已被广泛应用于ELISA检测中。由于TMB分子上4个甲基的存在, 尽管降低了致癌性, 但也使其水溶性显著降低, 甚至在底物溶液中的溶解度无法达到免疫检测水平。因此, 为提高其溶解性, DMSO、甲酰胺、乙酰胺、甲醇及酯类等已成功作为TMB的溶剂[5, 6]。底物溶液中的另一组分— — 过氧化氢, 因不存在溶解难的问题, 故可直接加到底物缓冲液中。鉴于TMB和过氧化氢在同一体系中不稳定的特性, 目前多数试剂盒采用只含TMB/过氧化氢的A/B两组分体系, 并以硫酸庆大霉素为防腐剂, 在显色时只需将两者等比例混合即可[7]。由于该体系无法控制真菌类污染物, 特别不适用于多次长时间使用。在本研究前期, 考虑到叠氮钠对过氧化物酶的抑制作用, 因此选择硫柳汞为防腐剂, 在使用过程中发现, 对于新鲜配制的底物溶液, 其反应特性没有受到影响, 但在4 ℃储存3个月后, 其A值显著降低。在此系统中分别补加TMB或过氧化氢后发现, 仅加入过氧化氢可使底物的A值恢复到初始水平。本研究中选择了DMSO作为TMB的溶剂, 并将PEG 也加到体系中, 致使溶液的极性显著降低。在此基础上加入一定量的无水乙醇, 这种组合不仅解决了TMB的溶解性, 而且乙醇还能起到防腐剂的作用。此外, PVP在医药上常作为增稠剂, 本研究中我们首先将过氧化氢尿素溶于底物缓冲液中, 于4 ℃贮存1周后加入PVP, 当此溶液充分平衡后, 再与事先配制好的TMB 溶液缓慢混合, 然后避光保存于4 ℃, 于不同时间检测其稳定性。结果显示, 该即用型TMB底物在敏感性及稳定性等方面均优于目前常规的A/B型两组分底物, 其在敏感性及稳定性上也优于Pierce公司的1-Step Turbo TMB底物。本研究中的即用型底物的良好稳定性可能与以下几点有关:(1)为了降低缓冲液中溶解氧的含量, 对于底物缓冲液先进行了高压灭菌, 并在其中加入了适量的还原剂, 这样不仅降低了游离氧的含量, 而且杀灭了其中的微生物; (2)以过氧化氢尿素替代了常用的双氧水, 并在其中加入增稠剂, 降低了溶液中过氧化氢分子与TMB分子相互接触的概率, 有利于底物溶液的稳定保存。

在进行底物的稳定性评价过程中, 由于A/B两组分底物不具有即用性, 因此仅对自制底物与Pierce公司的1-Step Turbo TMB底物进行了比较。应用37 ℃下加速试验检测底物的稳定性, 结果显示, 自制底物在37 ℃贮存60 d后的A值仍达0.8左右, 且高于1-Step Turbo TMB底物37 ℃贮存5 d的A值, 说明自制底物在4 ℃条件下可至少稳定保存19个月以上。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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