引用本文
沈薇, 顾怡, 张岚, 张纪蔚, 应春妹, 郁婷婷, 傅启华. 一例遗传性蛋白C缺陷症家系的实验诊断. 2011, 26(4): 243-245
SHEN Wei, GU Yi, ZHANG Lan, ZHANG Jiwei, YING Chunmei, YU Tingting, FU Qihua. Laboratory diagnosis of one pedigree with hereditary protein C deficiency. Labratory Medicine, 2011, 26(4): 243-245  
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一例遗传性蛋白C缺陷症家系的实验诊断
沈薇1, 顾怡1, 张岚2, 张纪蔚2, 应春妹1, 郁婷婷3, 傅启华3
1. 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,上海 200127
2. 上海交通大学医学院附属仁济医院血管外科,上海 200127
3. 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科,上海 200127

作者简介:沈薇,女,1977年生,学士,主管技师,主要从事血液学检验与研究工作。

通讯作者:傅启华,联系电话:021-38625568。

基金:上海市科委“浦江人才计划”A类资助项目(09PJ1407600); 仁济医院第四期学科建设资助项目(RJ4101309)
摘要
目的

对1例遗传性蛋白C缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。

方法

用发色底物法测定血浆蛋白C活性;用聚合酶链反应(PCR)法对先证者PC基因(PROC)的9个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者PROC基因突变区域扩增后测序,进行家系调查以期发现遗传规律。

结果

先证者蛋白C活性为38.6%,抗原为45.3%。直接基因测序分析发现先证者PROC基因外显子7区存在杂合错义突变c.565C>T,该突变将引起编码的蛋白C 147位精氨酸被色氨酸替换(p.Arg147Trp)。家系分析发现先证者的c.565C>T突变遗传于其父亲。

结论

c.565C>T杂合突变是导致该家系遗传性PC缺陷症的原因。

关键词: 蛋白C; 基因; 突变
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)04-0243-03
Laboratory diagnosis of one pedigree with hereditary protein C deficiency
SHEN Wei1, GU Yi1, ZHANG Lan2, ZHANG Jiwei2, YING Chunmei1, YU Tingting3, FU Qihua3
1. Department of Laboratory Medicine,Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200127, China
2. Department of Vascular Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127, China
3. Department of Laboratory Medicine,Shanghai Children's Medical Center, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127, China
Abstract
Objective

To study the laboratory diagnosis of one pedigree with hereditary protein C deficiency.

Methods

The plasma levels of protein C activity were detected by chromogenic assay. All of the 9 exons and intron-exon boundaries of protein C gene(PROC) were amplified by direct sequencing after purifing the corresponding amplified polymerase chain reaction (PCR) products in DNA from the propositus, and the gene mutation was also detected.The genetic development was analyzed by the research of family members.

Results

The plasma concentrations of protein C activity of the propositus was 38.6%, and that of antigen was 45.3%. Gene analysis revealed that the propositus had a c.565C>T heterozygous missense mutation at exon 7 of PROC gene, which would cause the amino acid substitution of Arg to Trp at position 147 (p.Arg147Trp). The pedigree analysis showed that c.565C>T mutation was inherited from father.

Conclusions

The c.565C>T heterozygous mutation leads to protein C hereditary deficiency for this pedigree.

Keyword: Protein C; Gene; Mutation
引言

蛋白C(protein C, PC)是一依赖维生素K的丝氨酸蛋白酶原, 是人体抗凝系统的重要因子之一, 主要由肝脏合成, 与蛋白S(protein S, PS)、凝血酶调节蛋白(thrombomodulin, TM)和内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein C receptor, EPCR)等共同组成PC系统, 在抗凝过程中起重要作用。遗传性PC缺陷症的临床表现很复杂, 并且是静脉血栓形成的重要危险因素之一。我们对1例遗传性PC缺陷症家系进行了表型和基因型检测。

材料和方法
一、家系资料

先证者, 男, 24岁, 2010年1月和4月分别因右下肢和左下肢深静脉血栓形成先后住院治疗。1月发生血栓后入组RECOVER-II研究, 因4月再发血栓而改为华法林治疗, 由于回家期间自行停服华法林1月余, 至6月广泛血栓形成。患者经彩色多普勒超声及CT影像学证实为下腔静脉血栓形成、慢性双侧腘静脉血栓形成、肝静脉血栓形成伴腹水、胸腔积液和肺部感染。2010年12月6日, 先证者弟弟也因深静脉血栓形成而收治入院。先证者父、母亲为表兄妹关系, 家系图见图1。

图1 PC缺陷症家系图

二、抗凝因子活性检测

1. 血标本的采集、处理和DNA抽提

所有家系成员静脉采血。采集静脉血, 0.109 mol/L枸橼酸钠1∶ 9抗凝, 立即于 4 ℃ 3 000 r/min离心(离心半径10 cm)10 min, 分离乏血小板血浆, 血浆分装后置于-80 ℃保存备用; 血细胞用北京天根(TianGen)公司DNA抽提试剂盒, 按说明书操作抽提DNA, -80 ℃保存待用。

2. PC活性和其他抗凝因子活性检测

PC活性(PC∶ A)、抗凝血酶活性(AT∶ A)测定采用发色底物法; 蛋白S活性(PS∶ A)测定采用凝固法(均为西门子公司产品), Sysmex CA-7000全自动血凝仪检测。肝肾功能项目在罗氏全自动生化仪上检测, 罗氏配套试剂。

三、PROC基因测序分析

1. 聚合酶链反应(PCR)

PCR引物除外显子2和3外, 按文献报道[1]的序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成。外显子2的引物序列为:上游 5'-GACAGCCCTTTCATTCCG-3', 下游5'-TTCCTGCCATTCCCATCT-3'; 外显子3的引物序列为:上游5'-TCTCCCAGCTCTGCTTCC-3', 下游5'-GCCTCAGCATTGAGTCCC-3'。 PCR总反应体积 25 μ L, 其中含2× PCR缓冲液, 2 mmol/L MgCl2(终浓度), 200 μ mol/L dNTP(终浓度), 引物终浓度0.5 μ mol/L, 模板DNA约200 ng, TaqDNA聚合酶热启动版本(Takara公司产品)1.25 U; 因外显子4-6区富含GC, 故扩增时用GC缓冲液(Takara公司产品)。先扩增先证者的PROC基因各个外显子及侧翼序列, 测序发现突变区域后, 再扩增其他家系成员的相应片段。PCR反应条件如下:95 ℃变性5 min, 然后95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 35个循环, 72 ℃延伸10 min。 (扩增外显子4-6区及其侧翼序列时, 退火温度为68 ℃)。PCR仪为Eppendorf DNA扩增仪。

2. 测序分析

PCR产物25 μ L, 加10 μ L载样缓冲液, 混匀, 加于8 g/L琼脂糖凝胶(含溴乙锭)中电泳后, 紫外灯下切取特异性PCR条带, 回收并纯化相应的 PCR产物。PCR纯化产物由北京六合华大基因科技股份有限公司上海测序部进行测序。家系成员基因检测仅限先证者基因突变区域。

结果
一、表型检测结果

先证者PC∶ A为38.6% , 其父亲、姐姐和弟弟PC∶ A也均有不同程度的下降, 母亲PC∶ A在正常范围之内, 家系成员PT、APTT、PS∶ A和 AT∶ A均基本正常(表1)。先证者与家系成员的肝肾功能均正常。

表1 先证者及其家系成员的抗凝因子和基因突变检测结果
二、PROC基因分析

对先证者的PROC基因所有9个外显子及侧翼序列PCR产物测序, 结果发现在PROC基因外显子7区存在杂合错义突变c.565C> T(图2), 引起编码氨基酸Arg147→ Trp。对该家系其他4名成员的 PROC基因第7外显子及侧翼序列PCR产物进行直接测序, 有3名成员在该位点也存在相同的突变。

图2 先证者外显子7测序结果(部分序列) 注:箭头所指为突变位点

讨论

本家系先证者有反复深静脉血栓形成病史, 经检查临床诊断为 “ 广泛深静脉血栓形成” 。实验室检查PC∶ A和PC∶ Ag 较正常下降, 而 PS∶ A 和 AT∶ A 均正常, 用溶栓和抗凝治疗病情好转, 由于PC∶ A较PC∶ Ag下降更多, 临床诊断为Ⅱ 型PC缺陷症。基因分析表明, 先证者 PC基因外显子7区存在 c.565C> T杂合错义突变, 导致 Arg147→ Trp。进一步对其家族其他成员检查发现, 先证者的父亲、姐姐和弟弟PC∶ A明显也低于参考值, 基因分析发现其PROC基因第7外显子也存在与先证者相同的杂合错义突变, 而母亲 PC∶ A和PROC基因测序分析均正常, 先证者弟弟在2010年12月6日, 也出现了深静脉血栓形成。说明该家系的 PC缺陷为遗传所致。

编码 PC蛋白的基因位于染色体 2q13~q14, 由9个外显子和 8个内含子组成, mRNA全长1 790bp, 由蛋白编码区(exon2~9)、5'端非翻译区(exon1及exon2中前21bp)和3'端非翻译区(exon9中后294bp)组成[2]。成熟PC分子由419个氨基酸(amino acid, aa)组成, 经蛋白酶解剪切去除Lys156-Arg157二肽, 形成由155个aa组成的轻链和由262个aa组成的重链, 二者通过Cys141与Cys277间的二硫键相连。凝血酶与凝血酶调节蛋白(TM)复合物对PC激活部位(Arg169-Leu170)的剪切使激活肽从重链释放, 从而形成活化PC(activated protein C, APC)。APC在蛋白S、磷脂等存在时, 特异性地裂解凝血因子V和Ⅷ , 将其灭活, 从而减少凝血酶的生成, 以达到抗凝的作用。Arg147位于轻链C'末端, 可能为APC结合凝血因子V的部位, 同时c.565C> T也为CpG双核苷酸高度突变位点。

截止到 2010年 7月底 , 在PC基因突变库中(http://www. hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=PROC)登记的突变种类已达262种 , 其中错义突变占193种。Tsay等 [3]对21例台湾PC缺乏病例进行突变位点分析, c.565C> T(p.Arg147Trp)突变的频率高达43%(9/21)。先证者与3位家属的突变位点与其报道一致, 提示该突变位点在中国人群中可能较普遍。

一般认为遗传性 PC缺陷症是常染色体显性遗传 , 但其临床表现极其多样性。在我们研究的家系中, 4名家系成员存在相同基因突变, 但目前仅先证者和弟弟出现静脉血栓。因此, 其他因素所致静脉血栓的发生也不容忽视。目前国内对遗传性蛋白C缺陷症的研究也越来越多, 并不断有新的突变位点发现[4, 5], 相信随着功能研究进一步进行, 将能进一步了解其在血栓形成中的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 周荣富, 王鸿利, 傅启华, 等. 蛋白C基因C5498T致I型遗传性蛋白质C缺陷症[J]. 中华医学杂志, 2003, 83(19): 1694-1697. [本文引用:1]
[2] Jackson CJ, Xue M. Activated protein C——an anti-coagulant that does more than stop clots[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(12): 2692-2697. [本文引用:1]
[3] Tsay W, Shen MC. R147W mutation of PROC gene is common in venous thrombotic patients in Taiwanese Chinese[J]. Am J Hematol, 2004, 76(1): 8-13. [本文引用:1] [JCR: 4.003]
[4] 王剑, 戴菁, 傅启华, 等. Pro 275 Ser纯合突变导致的Ⅱ型遗传性蛋白C缺陷症[J]. 血栓与止血学, 2009, 15(4): 149-153. [本文引用:1]
[5] 蔡晓红, 周荣富, 谢爽, 等. 两个遗传性蛋白C缺陷症家系临床表型和基因型变化的研究[J]. 中华血液学杂志, 2007, 28(3): 147-151. [本文引用:1]