结直肠癌患者外周血基因表达分析中参照基因的选择

引用本文

杜玉珍, 彭伟, 高锋. 结直肠癌患者外周血基因表达分析中参照基因的选择. 26(4): 239-242
DU Yuzhen, PENG Wei, GAO Feng. Selection of the suitable reference genes for gene expression analysis of human peripheral blood from patients with colorectal cancer. Labratory Medicine, 26(4): 239-242 复制到剪切板

Permissions

《检验医学》编辑部

结直肠癌患者外周血基因表达分析中参照基因的选择

杜玉珍, 彭伟, 高锋

上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海 200233

作者简介:杜玉珍,女,1972年生,博士,主管技师,主要从事分子诊断学相关研究。

通讯作者:高锋,联系电话:021-64369181-58702。

摘要

目的

筛选结直肠癌患者全血样本的合适内参照基因。

方法

以ACTB、GAPDH、GUSB、UBC、B2M、PBGD和18S rRNA为候选基因,用实时相对定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)稀释法检测其在8例结直肠癌患者和8名健康人全血中的表达水平,再用geNorm和NormFinder程序及两样本均数 t检验评价候选参照基因的稳定性,探寻应用于结直肠癌患者全血基因表达检测的合适参照基因。

结果

geNorm评估发现,最适合的参照基因是ACTB、GAPDH和GUSB;NormFinder计算结果认为GAPDH稳定性最好,B2M、ACTB和GUSB次之,推荐的参照基因组合是GAPDH和B2M;候选基因表达水平的组间比较(结直肠癌组和健康组)发现,除ACTB、GUSB和UBC之外,其他候选参照基因在组间表达差异有统计学意义。

结论

PBGD和18S rRNA不是结直肠癌全血样本的合适参照基因,而ACTB和GUSB是相对可以接受的参照基因。

关键词: 参照基因; 基因表达; 实时相对定量逆转录聚合酶链反应

中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)04-0239-04

Selection of the suitable reference genes for gene expression analysis of human peripheral blood from patients with colorectal cancer

DU Yuzhen, PENG Wei, GAO Feng

Department of Laboratory Medicine, the Sixth Hospital of Shanghai, Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China

Abstract

Objective To select the suitable endogenous reference genes in peripheral blood from patients with colorectal cancer for gene expression analysis. Methods The expressions of candidate reference geneswere determined in peripheral blood of8healthy subjects

Keyword:

Show Figures

引言

在基因表达研究中, 相对定量是评价实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)数据的常用策略。在相对定量中作为参照基因的管家基因需符合几个标准:在组织中应该具有持续的、非可调的、稳定的表达水平; 其表达水平应与样本中目的基因的表达水平相当; 通过严格的引物设计, 避免假基因, 以防基因组DNA扩增^{[1, 2]}。因此, 用实时相对定量RT-PCR进行基因表达分析时, 选择合适的参照基因是控制临床样本间变异性的先决条件。研究发现, 管家基因的表达水平在不同组织或同一组织不同疾病条件下并不恒定^{[3, 4]}。近年, 管家基因在不同肿瘤组织或外周血中表达存在差异的报道也越来越多^[5~7]。外周血是肿瘤患者基因表达分析的常见样本来源, 结直肠癌患者外周血样本参照基因的筛选还未见报道。本研究以ACTB、GAPDH、GUSB、UBC、B2M、PBGD和18S rRNA等常用的参照基因为候选基因, 用实时相对定量PCR(稀释法)检测比较这些候选基因在结直肠癌患者和健康人全血中的表达水平, 并用geNorm软件和NormFinder软件系统评价基因表达的稳定性, 找出最合适作为结直肠癌患者全血转录水平基因定量检测的参照基因。

材料和方法

一、材料

1. 研究对象

收集上海市第六人民医院2008年1至4月间8例结直肠癌初发病例外周血作为疾病组, 男5例, 女3例, 年龄30~82岁, 均经临床病理确诊。另外, 收集8名健康体检志愿者的外周血作为健康组, 男5名, 女3名, 年龄30~68岁。

2. 主要试剂和仪器

Trizol试剂为Invitrogen公司产品, RT试剂盒及PCR试剂盒为日本Takara公司产品; 荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI PRISM 7000 sequence detection system, 离心机为eppendorf centrifuge 5417R。

二、方法

1. RNA提取及质量控制

收集200 μ L静脉血(乙二胺四乙酸抗凝), 加生理盐水至250 μ L, 再加入750 μ L RNA提取试剂(Trizol)吹打混匀, -80 ℃储存或进行RNA提取。RNA提取按Trizol操作说明书, 用紫外分外光光度计测浓度及吸光度(A)260/A280比值, RNA电泳鉴定RNA提取质量及完整性。取1 μ g总RNA进行cDNA合成, cDNA合成步骤按逆转录酶使用说明书进行。

2. 实时定量RT-PCR

7个常用参照基因被用于结直肠癌外周血参照基因的筛选, 这些候选参照基因是ACTB、GAPDH、GUSB、UBC、B2M、PBGD和18S rRNA, 见表1。这些基因有不同的表达丰度, 属于不同的基因功能群。寡核苷酸引物由ABI生物公司的实时定量PCR专用引物设计软件完成。用ABI公司7700扩增系统、SYBR green 实时PCR体系完成候选内参考基因的相对定量检测。扩增体系为:cDNA模板1 μ L、引物(10 μ mol/L) 0.4 μ L、ROX reference Dye(50× ) 0.4 μ L, 加入灭菌去离子双蒸水至总体积20 μ L。所有样本均做双复管。定量PCR反应条件:预变性, 95 ℃ 10 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 40个循环。扩增效率、扩增相关系数、标准曲线斜率的获得以及相对定量水平的计算参照文献[8]进行。

表 1 候选参照基因的引物

三、质量控制

为避免错误的结论, 只有高质量的RNA提取样本和相对一致的PCR扩增效率才能为本研究所采纳。从8例患者和8名健康人获得高质量的RNA, 要求紫外分光光度计检测结果A260/A280比值为2.03± 0.15; 要求总RNA电泳结果28S/18S比值> 1.7, 以监测RNA的完整性; 要求PCR扩增效率在96%~105%之间, 标准曲线的相关系数在0.993~0.999之间。

四、数据分析

候选基因的稳定性比较及排序采用geNorm软件(3.5版本)和NormFinder程序来实现。geNorm软件可以从互联网上下载, 网址为http://medgen.ugent.be/genorm/。该软件通过计算候选参照基因的表达稳定性尺度(M), 逐步排除M值最高的基因, 该软件也提供方法确定需要几个内参考基因能实现正确的标准化。NormFinder程序附加在Excel软件上, 为每个候选参照基因计算其表达稳定性定值, 通过表达稳定性定值可以对候选基因在特定样本中的稳定性进行排序。稳定性定值基于组内、组间的基因表达变异系数。稳定性定值越低表示联合差异小, 基因表达的稳定性相对高。用NormFinder可以知道哪2个基因是最佳的内参考基因组合。用SPSS 15.0软件对实时定量PCR结果进行两样本均数比较的t检验及统计图绘制。

结果

一、不同样本候选参照基因的表达水平比较

这7个候选参照基因表达范围宽, 循环数(Ct值)在11.65~26.28之间。用箱式图对结直肠癌患者和健康人的全血候选参照基因表达水平进行了比较, 见图1。箱式图两端的短柄和箱体是基因表达的分布范围, 箱体的上下线是四分位值, 箱体中间的横线是中位数。18S rRNA在结直肠癌患者和健康人全血中表达最高, B2M次之, GUSB和GAPDH转录在全血中最少。

	Figure Option View Download New Window
	图1 候选参照基因在结直肠癌患者和健康人全血中的表达水平

另外用两样本比较t检验对7个基因在2种样本的表达水平进行比较, 结果见表2。B2M、PBGD、GAPGH、18S rRNA在2组间表达差异有统计学意义(P< 0.05), ACTB、UBC、GUSB在2组间表达差异无统计学意义, 是比较合适的参照基因。

表2 候选参照基因在结直肠癌组和健康组表达的水平(

± s)

二、候选参照基因表达的稳定性

7个候选基因的相对定量PCR结果用geNorm程序处理, 按计算出的M值排序, 见图2(a)。M值为某个候选基因与其他候选基因配对所得配对变异, M值越大说明该基因在候选基因中的配对变异越大。本研究中ACTB、GAPDH、GUSB、UBC、B2M、PBGD和18S rRNA的M值均小于推荐阈值1.5, 但18S rRNA和B2M具相对大的M值, GAPDH和ACTB的M值相对小。按geNorm程序, GAPDH和ACTB是最佳的参照基因组合。为了获得实现标准化的最佳参照基因数, geNorm程序计算了序列标准化因子的配对变异大小, 见图2(b), 可以看出3个基因组成的参照基因组其标准化因子的变异最小(V3/4), 如果再引入一个参照基因, 标准化因子变异又变大。即通过geNorm程序分析, 认为GAPDH、ACTB和GUSB是最佳的参照基因组合。

	Figure Option View Download New Window
	图2 geNorm程序分析候选参照基因的稳定性注:(a)剩余参照基因的M值; (b)用于标准化的最佳参照基因数的确定

用NormFinder程序对这些候选参照基因的稳定性进行评估, 结果见表3。发现GAPDH最稳定, 其次是B2M、ACTB、GUSB等, 最佳的参照基因组合是GAPDH和B2M, 其联合的稳定性值为0.128。

表3 NormFinder程序计算各候选参照基因的稳定性

讨论

基因表达技术如定量实时RT-PCR、表达芯片以及Northern印迹等都需要准确的标准化方法以得到可靠的定量数据。一种比较通用的方法是使用参照基因, 使用参照基因的目的在于去除非生物学变化引起的差异。然而大量的报道表明, 常用的参照基因在不同组织或不同的试验条件下变化很大。因此, 事实上不存在能应用于所有组织、所有试验条件的的通用参照基因。

为解决这个问题, 最好的参照基因应该由不同的组织、不同的试验条件来确定。并且, 在标准化过程中多个参照基因的联合使用比单个基因更加可靠^[9]。因此本研究用了7个常用的参照基因来筛选结直肠癌患者全血样本的参照基因。

在本研究中, 首先对结直肠癌组和健康组候选基因的Ct值进行两样本均数比较t检验, 发现ACTB、GUSB和UBC这3个候选基因在两组间差异无统计学意义, 而GAPDH、B2M、PBGD和18S rRNA的表达在结直肠癌组和健康组间差异有统计学意义。因此t检验结果提示, ACTB、GUSB和UBC较适合作为结直肠癌患者全血样本的候选参照基因。

另外在本研究中, 我们用了2种不同统计模型来计算最稳定的参照基因。一种是基于配对比较的模型— — geNorm, 另一种是基于分析变异系数的模型— — NormFinder。由geNorm程序发现ACTB和GAPDH是最稳定表达的参照基因, GUSB是第3稳定的参照基因。然而, 由NormFinder程序计算的结果发现, GAPDH是最稳定的参照基因, GAPDH和B2M联合是最稳定的参照基因组合, ACTB和GUSB作为参照基因的稳定性依次排列。

综合上述3种方法对候选参照基因的评价结果, 认为ACTB和GUSB是较理想的参照基因, 但不能提示他们联合应用的效果情况。而PBGD和18S rRNA在结直肠癌患者全血样本中不是合适的参照基因。

本研究只从参照基因在不同来源样本中的稳定性情况详细阐述如何评价和选择合适的参照基因。针对特定的目的基因, 还应该考虑目的基因的丰度以及目的基因与参照基因RNA的降解动力学是否一致等因素。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

View Option

[1]	Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, et al. Housekeeping genes as internal stand ards: use and limits[J]. J Biotechnol, 1999, 75(2-3): 291-295. [本文引用:1] [JCR: 3.183]
[2]	Radonic A, Thulke S, Mackay IM, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 313(4): 856-862. [本文引用:1]
[3]	Geraci G, D'Elia I, Del Gaudio R, et al. Evidence of genetic instability in tumors and normal nearby tissues[J]. PLoS One, 2010, 5(2): e9343. [本文引用:1] [JCR: 3.73]
[4]	张艳君, 朱志峰, 陆融, 等. 基因表达转录分析中内参基因的选择[J]. 生物化学与生物物理进展, 2007, 34(5): 546-550. [本文引用:1]
[5]	Li YL, Ye F, Hu Y, et al. Identification of suitable reference genes for gene expression studies of human serous ovarian cancer by real-time polymerase chain reaction[J]. Anal Biochem, 2009, 394(1): 110-116. [本文引用:1] [JCR: 2.582]
[6]	Stamova BS, Apperson M, Walker WL, et al. Identifica-tion and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood[J]. BMC Med Genomics, 2009, 2(1): 49. [本文引用:1] [JCR: 3.466]
[7]	Valente V, Teixeira SA, Neder L, et al. Selection of suitable housekeeping genes for expression analysis in glioblastoma using quantitative RT-PCR[J]. BMC Mol Biol, 2009, 10(1): 17. [本文引用:1] [JCR: 2.796]
[8]	Kwon MJ, Oh E, Lee S, et al. Identification of novel reference genes using multiplatform expression data and their validation for quantitative gene expression analysis[J]. PLoS One, 2009, 4(7): e6162. [本文引用:1] [JCR: 3.73]
[9]	Vand esompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol, 2002, 3(7): RESEARCH0034. [本文引用:1]

1999

3.183

0.0

. 1999, 75(2-3):null-null

Housekeeping genes as internal standards: use and limits

... 通过严格的引物设计,避免假基因,以防基因组DNA扩增^[1,2] ...

2004

0.0

. 2004, 313(4):null-null

Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR

... 通过严格的引物设计,避免假基因,以防基因组DNA扩增^[1,2] ...

2010

3.73

0.0

PLoS ONE. 2010, 5(2):e9343-null

Evidence of Genetic Instability in Tumors and Normal Nearby Tissues

Giuseppe Geraci 1,2 ,Rossella Di Giaimo 1 ,Ida D'Elia 1 ,Rosanna del Gaudio 1

1 Department of Biological Sciences, University of Naples Federico II, Napoli, Italy 2 Ceinge Biotecnologie Avanzate s.c. a r.l., Napoli, Italy

Background Comprehensive analyses have recently been performed on many human cancer tissues, leading to the identification of a number of mutated genes but providing no information on the variety of mutations present in each of them. This information is of interest to understand the possible origin of gene mutations that cause tumors. Methodology/Principal Findings We have analyzed the sequence heterogeneity of the transcripts of the human HPRT and G6PD single copy genes that are not considered tumor markers. Analyses have been performed on different colon cancers and on the nearby histologically normal tissues of two male patients. Several copies of each cDNA, which were produced by cloning the RT-PCR-amplified fragments of the specific mRNA, have been sequenced. Similar analyses have been performed on blood samples of two ostensibly healthy males as reference controls. The sequence heterogeneity of the HPRT and G6PD genes was also determined on DNA from tumor tissues. The employed analytical approach revealed the presence of low-frequency mutations not detectable by other procedures. The results show that genetic heterogeneity is detectable in HPRT and G6PD transcripts in both tumors and nearby healthy tissues of the two studied colon tumors. Similar frequencies of mutations are observed in patient genomic DNA, indicating that mutations have a somatic origin. HPRT transcripts show genetic heterogeneity also in healthy individuals, in agreement with previous results on human T-cells, while G6PD transcript heterogeneity is a characteristic of the patient tissues. Interestingly, data on TP53 show little, if any, heterogeneity in the same tissues. Conclusions/Significance These findings show that genetic heterogeneity is a peculiarity not only of cancer cells but also of the normal tissue where a tumor arises.

... 研究发现,管家基因的表达水平在不同组织或同一组织不同疾病条件下并不恒定^[3,4] ...

2007

0.0

... 研究发现,管家基因的表达水平在不同组织或同一组织不同疾病条件下并不恒定^[3,4] ...

2009

2.582

0.0

. 2009, 394(1):null-null

Identification of suitable reference genes for gene expression studies of human serous ovarian cancer by real-time polymerase chain reaction

... 近年,管家基因在不同肿瘤组织或外周血中表达存在差异的报道也越来越多^[5~7] ...

2009

3.466

0.0

2009

2.796

0.0

... 近年,管家基因在不同肿瘤组织或外周血中表达存在差异的报道也越来越多^[5~7] ...

2009

3.73

0.0

PLoS ONE. 2009, 4(7):e6162-null

Identification of Novel Reference Genes Using Multiplatform Expression Data and Their Validation for Quantitative Gene Expression Analysis

Ensel Oh 2 ,Taesung Park 3 ,Sang Seok Koh 7 ,Si Eun Kim 1 ,Mi Jeong Kwon 1 ,Yong-Ho In 4 ,Yangsoon Lee 5 ,Seungmook Lee 3 ,Young Kee Shin 1,2 ,Mi Ra Roh 4 ,Yoon-La Choi 6

1 Laboratory of Molecular Pathology, Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Seoul National University, Seoul, Korea 2 Interdiciplinary Program of Bioinformatics, College of Natural Science, Seoul National University, Seoul, Korea 3 Department of Statistics, College of Natural Science, Seoul National University, Seoul, Korea 4 BIT center, CT&D Ltd., Seoul, Korea 5 LG Life Sciences, Ltd., R&D Research Park, Daejeon, Korea 6 Department of Pathology, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea 7 Protein Therapeutics Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon, Korea

Normalization of mRNA levels using endogenous reference genes (ERGs) is critical for an accurate comparison of gene expression between different samples. Despite the popularity of traditional ERGs (tERGs) such as GAPDH and ACTB , their expression variability in different tissues or disease status has been reported. Here, we first selected candidate housekeeping genes (HKGs) using human gene expression data from different platforms including EST, SAGE, and microarray, and 13 novel ERGs (nERGs) ( ARL8B, CTBP1, CUL1, DIMT1L, FBXW2, GPBP1, LUC7L2, OAZ1, PAPOLA, SPG21, TRIM27, UBQLN1, ZNF207 ) were further identified from these HKGs. The mean coefficient variation (CV) values of nERGs were significantly lower than those of tERGs and the expression level of most nERGs was relatively lower than high expressing tERGs in all dataset. The higher expression stability and lower expression levels of most nERGs were validated in 108 human samples including formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues, frozen tissues and cell lines, through quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR). Furthermore, the optimal number of nERGs required for accurate normalization was as few as two, while four genes were required when using tERGs in FFPE tissues. Most nERGs identified in this study should be better reference genes than tERGs, based on their higher expression stability and fewer numbers needed for normalization when multiple ERGs are required.

0.0

... 并且,在标准化过程中多个参照基因的联合使用比单个基因更加可靠^[9] ...