引用本文
曾昭瑛, 赵秀英, 于艳华, 何菡, 郭彩萍, 孙桂珍. 血培养联合PCR对HIV感染者和AIDS患者分枝杆菌血症诊断的分析. 2011, 26(4): 235-238
ZENG Zhaoying, ZHAO Xiuying, YU Yanhua, HE Han, GUO Caiping, SUN Guizhen. Analysis on blood culture combined with PCR for the detection of Mycobacterium in patients infected with HIV and with AIDS . Labratory Medicine, 2011, 26(4): 235-238  
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血培养联合PCR对HIV感染者和AIDS患者分枝杆菌血症诊断的分析
曾昭瑛, 赵秀英, 于艳华, 何菡, 郭彩萍, 孙桂珍
首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心,北京 100069

作者简介:曾昭瑛,女,1986年生,硕士,主要从事人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征机会性感染的诊断研究。

通讯作者:赵秀英,联系电话:010-83997300。

基金:北京自然科学基金资助项目(5072021)
摘要
目的

评价应用BACTEC Myco/F Lytic(MFL)培养基血培养联合聚合酶链反应(PCR)对人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者合并分枝杆菌(MB)感染诊断的效果。

方法

用MFL配合BACTEC 9120血培养仪对55例可疑合并MB感染的HIV/AIDS患者血标本进行培养,联合抗酸染色和PCR对阳性标本进行菌种鉴定。

结果

55例患者血培养分析显示,MFL血培养的总报阳率为32.7%(18/55),其中7例(12.7%)报阳标本经证实为MB生长,8例(14.5%)报阳标本中未检出任何微生物,暂定为假报警,3例( 5.4%)检出污染菌。其中MB的平均培养周期为746.79 h,约31.1 d。7例MB培养阳性标本经PCR鉴定,5例(71.4%)为结核分枝杆菌(TB),2例(28.6%)为鸟分枝杆菌复合体(MAC)。

结论

MFL血培养能协助临床诊断MB血症,该法操作简单、安全性高,但培养周期较长,且存在假报警及某些需氧菌污染的情况,故宜联合其他检测手段对MB血症进行检测。

关键词: BACTEC Myco/F Lytic 培养基; 聚合酶链反应; 人类免疫缺陷病毒; 获得性免疫缺陷综合征; 分枝杆菌
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)04-0235-04
Analysis on blood culture combined with PCR for the detection of Mycobacterium in patients infected with HIV and with AIDS
ZENG Zhaoying, ZHAO Xiuying, YU Yanhua, HE Han, GUO Caiping, SUN Guizhen
Clinical Laboratory Center, You'an Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Abstract
Objective

To evaluate the diagnosis value of BACTEC Myco/F Lytic (MFL) medium on blood culture combined with polymerase chain reaction(PCR) for detection of Mycobacterium (MB) in human immunodeficiency virus (HIV) and acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients.

Methods

A total of 55 blood specimens from HIV/AIDS patients were inoculated in MFL medium, and then were placed in BACTEC 9120 blood culture system. Acid fast stain and PCR were used for the MB identification of all positive samples.

Results

The 18(32.7%) samples out of 55 were reported as positive by the BACTEC 9120 blood culture system, including 7(12.7%) samples were found as MB [5(71.4%) MB tuberculosis (TB) and 2 (28.6%) MB avium complex (MAC) identified by PCR], 8(14.5%) samples were temporarily considered as false positive, and 3(5.4%) samples were found as contaminated bacteria.The average time for the detection of MB was 746.79 h, about 31.1 d.

Conclusions

Although blood culture with MFL medium is a simple and safe diagnostic method for the detection of MB, the long turnaround time, possible false positive report and aerobic bacterial contamination make it of limited usefulness.MFL medium blood culture should combine with other assays for the MB detection.

Keyword: BACTEC Myco/F Lytic medium; Polymerase chain reaction; Human immunodeficiency virus; Acquired immune deficiency syndrome; Mycobacterium
引言

分枝杆菌(MB)感染是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者最常见的机会性感染之一, 也是最主要的致死原因。早期检测并发现MB感染的情况, 及时采取抗结核治疗对提高HIV/AIDS患者的生存率及生存质量, 同时防止MB感染向普通人群扩散具有极其重大的意义[1]。然而, HIV/AIDS患者合并MB感染的临床症状多不典型, 且传统检测方法(抗酸染色、罗氏培养基)检出率不高, 因而难以获得准确的病原学诊断依据[2]。BACTEC Myco/F Lytic(MFL)培养基是一种新型的MB液体培养基, 含有营养丰富的Middlebrook 7H9、脑心浸液肉汤、枸橼酸铁铵(提供某些特殊类型MB生长所需的离子)、皂素(溶解血液中红细胞)、抗菌药物(抑制普通细菌生长), 并且添加了一些蛋白质和糖类以促进MB生长[3]。本研究采用该液体培养基结合聚合酶链反应(PCR)检测手段对疑似合并MB感染的HIV/AIDS患者的外周血进行了培养分析。

材料和方法
一、标本来源

2009年3至12月间北京佑安医院感染科收治的55例疑似合并MB感染的HIV/AIDS患者的外周血标本。所有患者确定诊断符合中华人民共和国卫生部2008年颁布的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》。疑似MB感染的HIV/AIDS患者多伴有长期不明原因发热、体重减轻等消耗性临床表现。

二、仪器及试剂

BD公司MFL培养基、BACTEC 9120 血培养系统和Pheonix 100 细菌鉴定仪; Baso公司抗酸染色试剂及革兰染色试剂; Stratagene公司Mx3000荧光定量PCR仪。所有引物均由上海生工公司合成。

三、标本采集与接种

抽取15~20 mL患者的外周血标本, 无需前处理直接加入MFL培养基中, 然后放入BACTEC 9120血培养系统内进行培养。要求每位患者至少采集2次外周血标本, 采血过程严格遵守血培养检测规范化操作[4]。

四、仪器报警阳性标本的处理

取出机器报警阳性的培养基, 用1 mL无菌注射器自瓶内取出适量培养液涂抹至2张洁净无划痕的玻片上, 经30 min紫外线灭菌处理后, 分别行抗酸染色及革兰染色。所有抗酸染色阳性的标本利用PCR进行菌型鉴定, 抗酸染色阴性的标本转种血平皿、麦康凯培养基和沙保罗培养基, 若有微生物生长, 利用Pheonix 100细菌鉴定仪对其进行鉴定。标本培养至第42天时, 若仍无阳性报警, 则机器自动判定为培养阴性, 取出阴性培养基妥善丢弃。

五、菌属及菌种鉴定

采用5 mL无菌注射器从阳性培养基内抽取1.5 mL培养液至无菌Eppendorf 管, 13 000 r/min(离心半径为8.61 cm)离心10 min, 弃上清液, 沉淀物经沸水煮沸30 min用于DNA提取。用MB属特异性PCR引物对阳性标本进行PCR扩增, 具体引物序列及PCR循环条件见表1。50 μ L反应体系含10× PCR缓冲液5 μ L, 25 mmol/L MgCl2 5 μ L, dNTPs 200 μ mol/L, 上、下游引物各1 μ mol/L, 模板DNA 10 μ L, Taq DNA聚合酶1 U。MB属特异性引物扩增证实为MB的标本, 再次行结核分枝杆菌(TB)特异性引物和鸟分枝杆菌复合体(MAC)特异性引物的双重PCR扩增。所有扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳证实。以上操作过程均在生物安全柜内完成, 严格遵守生物安全操作规程。

表1 PCR分型鉴定中所用的特异性引物及循环条件
结果
一、MFL培养基外周血标本培养结果分析

55例疑似合并MB感染的HIV/AIDS患者外周血标本经MFL培养基培养, 有18例(32.7%)标本仪器报警阳性。培养物经抗酸染色、特异性PCR引物扩增检测后, 有7例患者证实合并有MB血症, 占12.7%。有3例报警阳性的标本, 取培养液涂片革兰染色后发现2例为革兰阳性球菌, 1例为革兰阳性杆菌, 经Pheonix 100微生物鉴定系统鉴定分别为表皮葡萄球菌、微球菌属和解脲棒杆菌, 污染率为5.4%。另外, 发现8例(14.5%)报警阳性的标本, 行革兰染色、抗酸染色均未找到可疑微生物, 转种至血平皿、麦康凯培养基和沙保罗培养基后无任何微生物生长, 行MB特异性引物PCR检测后, 亦未发现培养瓶内有MB生长, 判断为“ 假阳性” 报警。

二、报警时间分析

在本研究中利用MFL培养基培养MB的平均周期为746.79 h(31.1 d), 最快报阳时间为233 h(9.7 d), 最慢为984 h(41 d)。3例标本因污染菌生长而报警阳性的时间分别为20、59和67 h, 平均为48.6 h(2 d)。而8例疑为假阳性的标本报阳时间平均为620.9 h(25.9 d)。

三、MB分型鉴定和临床资料总结

7例MB培养阳性的标本经PCR分型鉴定后, 有5例(71.4%)为TB, 2例(28.6%)为MAC。结合这7例MB培养阳性患者的临床资料, 患者平均年龄36.2岁, 均为男性, 57.1%(4/7)的患者CD4+T淋巴细胞计数< 50个/μ L。所有患者的红细胞沉降率(ESR)均> 50 mm/h。

讨论

采用MFL培养基配合BACTEC 9120血培养系统联合PCR检测, 能够协助临床医生诊断HIV/AIDS合并MB血症。这种液体培养基具有全封闭无放射性、非侵袭性操作、无需前处理等优点, 同时能够防止交叉污染的发生。整个血培养系统的培养过程完全自动化, 能够严格保障实验室质量控制的精确性, 极大地减少了系统误差及偶然误差。

然而, 该检测方法仍然存在很多的局限性。首先, MFL培养基除了能对MB培养以外, 真菌及某些需氧菌也能在该培养基内生长, 如荚膜组织胞浆菌、新型隐球菌等[8]。因此, 当患者单独或同时合并真菌或需氧菌感染时, 该培养基报警阳性不一定是因为培养出了MB。对HIV/AIDS患者而言, 由于免疫力极度低下, 同时合并有MB和真菌感染的情况是极有可能出现的。其次, 采用MFL培养基对外周血标本进行MB培养的周期较长, 国外的研究报道长短不一, 从14~26 d不等[9~11], 本研究所得的平均培养周期为746.79 h(31.1 d)。有些国外研究认为MAC较TB培养周期较短[10], 因本研究的阳性例数不多, 尚无法对2种MB的培养周期做比较。

本研究中有8例阳性报警疑为“ 假阳性” , 查阅国内外文献仅发现极少数有关MFL培养基假阳性的报道。但Daxboeck等[12]所做的一项关于BACTEC血培养系统假阳性的研究指出, 尽管通常认为假阳性报警是由于某种苛养微生物的生长所造成的, 但血培养仪的全自动化检测技术本身的缺陷或偶然差错很可能是导致假阳性的真正原因。另外, 本研究为提高阳性率采血量设为15~20 mL(BD公司关于MFL培养基的采血量建议为1~5 mL), 而全血白细胞过高时可释放一定量的CO2造成机器假阳性报警, 故采血量过多亦可能为本研究假阳性率高的原因之一。本研究中有3例污染标本, 根据细菌鉴定结果可推测为采血时皮肤消毒不合格所致, 因而要求护士应严格按照规范化采血过程来执行, 力求标本污染率降到最低。

从本研究中发现, 收治的HIV/AIDS患者合并MB血症多由TB引起, MAC感染也可见于个别病例。结合7例MB培养阳性HIV/AIDS患者的其他临床资料, 我们发现当CD4+ T淋巴细胞计数< 100个/μ L时, 患者容易合并MB血症, 且ESR多明显升高(> 50 mm/h)。因此临床在碰到疑似合并MB感染的HIV/AIDS患者时, 除了送检可疑感染部位标本(如痰、胸水、脑脊液等)行MB培养外, 还可同时送检血MB培养, 并结合患者其他临床资料尽早做出诊断, 及时用药治疗。

MFL培养基联合PCR能够协助临床诊断MB血症, 但培养周期较长, 且同时可以培养真菌, 故不适用于单独应用于MB的临床诊断, 宜联合其他检测手段对MB进行检测, 以提高阳性率, 缩短培养周期。

The authors have declared that no competing interests exist.

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